Name: rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00
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हम एडम कोस्टर और उपयोगी प्रतिक्रिया और विचार विमर्श के लिए Altschuler और वू लैब्स के अन्य सभी सदस्यों को धन्यवाद. इस शोध स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया R01 GM085442 और CA133253 (SJA), R01 GM081549 (एलएफडब्ल्यू), CPRIT RP10900 (एलएफडब्ल्यू), और वेल्श फाउंडेशन मैं-1619 (SJA) अनुदान और मैं-1644 (एलएफडब्ल्यू).

1. तैयारी नमूने और इमेजिंग <ol><li> सेल संस्कृति <ol><li> नियमित संस्कृतियों भाजित और 20-70% संगम पर बनाए रखें. प्रयोग करने से पहले एक दिन, (, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम सामग्री की तालिका देखें) DMEM में HELA कोशिकाओं के बढ़ने और 10%...

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

यहाँ वर्णित कार्यप्रवाह तेज और आसान लक्षण वर्णन और माइक्रोस्कोपी छवियों की तुलना की अनुमति देता है. हम पहली बार इस कार्यप्रवाह जल्दी माइक्रोस्कोपी छवियों पर गुणवत्ता नियंत्रण के प्रदर्शन से उदाहरण ...

पिछले दशक के दौरान, इमेजिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में तेजी से प्रगति के कई प्रयोगशालाओं उच्च throughput माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने की क्षमता दे दिया है. अब चुनौती विश्लेषण से एक के लिए इमेजिंग में से एक से स्थानांतरित कर दिया गया है. कैसे हम तुलना, विशेषताएँ, और एक ठेठ उच्च throughput इमेजिंग स्क्रीन द्वारा उत्पन्न जटिल अभी तक सूक्ष्म phenotypes की धार तलाश कर सकते हैं? छवि विश्लेषण और सूचना विज्ञान प्लेटफार्मों के एक नंबर छवियों के बड़े संग्रह से जैविक जानकारी निकालने के लिए उपयोगकर्ताओं को परिष्कृत toolboxes 1-3 दे दिया है. फिर भी कई महत्वपूर्ण बाधाओं उच्च throughput छवि आधारित स्क्रीन से डेटा का विश्लेषण करने में रहते हैं. (ब्याज की व्यवस्था करने के लिए) छवियों और एल्गोरिथम मापदंडों के ठीक ट्यूनिंग की उचित अभिलक्षण चुनने के साथ कठिनाइयों अक्सर विशेष रूप से छवि विश्लेषण विशेषज्ञता के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए लंबे समय सेटअप समय में परिणाम. विशेष रूप से, सेल विभाजन, एक में व्यक्ति की कोशिकाओं की पहचान करने की प्रक्रियाn छवि, इस संबंध में एक बड़ी अड़चन है. विभाजन इस तरह के सेल प्रकार, सेल घनत्व और जैव मार्कर के रूप में प्रयोगात्मक मापदंडों को अत्यधिक संवेदनशील हो, और अक्सर एक बड़े डेटा सेट के लिए दोहराया समायोजन की आवश्यकता कर सकते हैं. इन कारणों के लिए, छवि विश्लेषण अक्सर बल्कि प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह का एक एकीकृत हिस्सा से विशेषज्ञों द्वारा निष्पादित एक स्वतंत्र, टर्मिनल कदम है. इस विश्लेषण और प्रयोग, परख विकास का एक महत्वपूर्ण भाग के बीच तेजी से प्रतिक्रिया चक्र precludes. यहाँ हम उच्च throughput प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए अनुकूलित और aforementioned कठिनाइयों के कई टाल रहा है कि एक वैकल्पिक कार्यप्रवाह वर्णन. यह अंत करने के लिए, हम PhenoRipper 4, तेजी से अन्वेषण और माइक्रोस्कोपी छवियों के विश्लेषण के लिए एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म का इस्तेमाल करते हैं. गौरतलब है कि PhenoRipper एकल कक्षों की पहचान करने का प्रयास नहीं द्वारा सेल विभाजन के साथ शामिल चुनौतियों के कई बचा जाता है. इसके बजाय, PhenoRipper पिक्सेल में छवियों को विभाजित करता हैsubcellular आकार के ब्लॉक और वे होते ब्लॉकों के मामले में छवियों की विशेषता है. विशेष रूप से, PhenoRipper मार्कर colocalization आधारित सुविधाओं के मामले में ब्लॉक प्रोफाइल और स्वचालित रूप से प्रशिक्षण छवियों में सबसे अधिक प्रतिनिधि ब्लॉक प्रकार 4 पहचानती है. PhenoRipper तो प्रत्येक ब्लॉक ज्यादा समान प्रतिनिधि ब्लॉक का प्रकार देता है, और अंत में वे शामिल ब्लॉकों के प्रकार के आधार पर छवियों की विशेषता है. अधिक पारंपरिक एकल कोशिका आधारित दृष्टिकोण की तुलना में, इस दृष्टिकोण न्यूनतम ठीक ट्यूनिंग और विशेषज्ञता की आवश्यकता है. ब्लॉक आकार और ग्राफिकल राय के साथ स्थापित कर रहे हैं, जो दोनों के एक दहलीज तीव्रता (एक छवि के noncellular अंश त्यागने के लिए), जैसे:, उपयोगकर्ताओं को केवल दो मानकों सेट करने की जरूरत है. महत्वपूर्ण बात है, यहाँ वर्णित कार्यप्रवाह गति और कम से कम ठीक ट्यूनिंग बड़ी समय और विश्वसनीयता लाभ प्रदान करता है जहां बहुत बड़ा डेटा सेट, को आसानी से पैमाने पर करने के लिए 4 दिखाया गया है. अभ्यास में, हम पाते हैं कि इस एप्लिकेशनरोच दोनों परिमाण 4 के कई आदेशों द्वारा सेटअप और चलाने के लिए आवश्यक समय कम कर देता है. PhenoRipper के प्राथमिक उत्पादन कोशिकाओं समान phenotypes प्रदर्शित करने का कारण है कि प्रयोगात्मक शर्तों के समूहों की पहचान करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है, जो छवि समानता का एक दृश्य प्रतिनिधित्व है. आम तौर पर पाता PhenoRipper समूहों और अधिक समय लेने वाली है, सेल आधारित विधियों 4 द्वारा उत्पन्न उन लोगों के बराबर &quot;जैविक विवेचनीयता&quot; है. व्यवहार में, यह अक्सर एक ठेठ 96 अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोग का प्रदर्शन करने के आधे घंटे के भीतर, पूर्व छवि विश्लेषण अनुभव के बिना एक प्रयोगकर्ता अपने या अपने प्रयोग के प्रदर्शन के बारे में एक विश्वसनीय readout मिल सकता है. प्रयोगकर्ता तो विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के बीच संबंधों की खोज और छवि phenotypes करने के लिए इन रिश्तों से संबंधित शुरू कर सकते हैं. हम प्रभाव का विश्लेषण करके यहाँ इस कार्यप्रवाह का प्रदर्शनडीएनए और cytoskeletal मार्करों के लिए दाग HELA कोशिकाओं पर अलग यंत्रवत कक्षाओं में दवाओं की. दवाओं की एक ही वर्ग के साथ इलाज किया कोशिकाओं की छवियों को एक साथ समूहीकृत, और (इतने पर ध्यान केंद्रित करने और कोशिकाओं के बाहर धुंधला कलाकृतियों) गरीब गुणवत्ता के चित्र की पहचान करने और संभावित त्यागने के लिए उन्हें आसान बनाने, outliers के रूप में प्रकट हुए थे. इस कार्यप्रवाह छवि आधारित assays की एक बड़ी संख्या के लिए उपयोगी है, एक अलग दृष्टिकोण संभवतः अधिक जानकारीपूर्ण हो सकता है, जहां स्पष्ट रूप से कई स्थितियों रहे हैं. उदाहरण के लिए, PhenoRipper से उत्पादन मुख्य रूप से प्रयोगात्मक शर्तों के पार प्रतिदीप्ति पैटर्न के एक रिश्तेदार की तुलना है. एक विशिष्ट एकल कक्ष विशेषता का एक निरपेक्ष लक्षण वर्णन (एक सेल में speckles के उदाहरण के लिए संख्या) के बजाय आवश्यक था, तो एक एकल कोशिका आधारित विश्लेषण की आवश्यकता होगी. फिर भी, यहां तक ​​कि इस प्रकार की स्थिति में, PhenoRipper इन एकल कक्ष phenotypes में परिवर्तन का पता लगाने की संभावना है और इसलिए परख OPTI के लिए एक उपयोगी उपकरण होmization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

उच्च throughput माइक्रोस्कोपी में तेजी से प्रगति के बावजूद, मात्रात्मक छवि आधारित assays अभी भी महत्वपूर्ण चुनौतियों मुद्रा. विशेष छवि विश्लेषण उपकरणों की एक किस्म उपलब्ध हैं, ज्यादातर परंपरागत छवि विश्लेषण आधारित workflows (विश्लेषण मापदंडों के ठीक ट्यूनिंग के लिए) तेजी से सीखने से घटता है और इमेजिंग और विश्लेषण के बीच लंबे समय से बदलाव के समय में परिणाम. विशेष रूप से, सेल विभाजन, एक छवि में व्यक्ति की कोशिकाओं की पहचान करने की प्रक्रिया, इस संबंध में एक बड़ी अड़चन है. यहाँ हम PhenoRipper, तेजी से विश्लेषण और माइक्रोस्कोपी छवियों के अन्वेषण के लिए बनाया गया एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म पर आधारित एक वैकल्पिक, सेल विभाजन से मुक्त कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं. यहाँ प्रस्तुत पाइपलाइन सेल संस्कृतियों के immunofluorescence माइक्रोस्कोपी छवियों के लिए अनुकूलित और न्यूनतम उपयोगकर्ता हस्तक्षेप की आवश्यकता है. आधे घंटे के भीतर, PhenoRipper एक ठेठ 96 अच्छी तरह से प्रयोग से डेटा का विश्लेषण और छवि प्रोफाइल उत्पन्न कर सकते हैं. उपयोगकर्ताओं कर सकते हैंतो नेत्रहीन, अपने डेटा का पता लगाने के उनके प्रयोग पर गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रदर्शन, perturbations के जवाब सुनिश्चित करने और प्रतिकृति के reproducibility की जाँच करें. इस विश्लेषण और परख अनुकूलन के दौरान महत्वपूर्ण है जो प्रयोग के बीच एक तीव्र प्रतिक्रिया चक्र की सुविधा. इस प्रोटोकॉल में ही नहीं, गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक पहली पास विश्लेषण के रूप में उपयोगी है, लेकिन यह भी एक को समाप्त करने के लिए अंत समाधान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से स्क्रीनिंग के लिए. यहाँ वर्णित कार्यप्रवाह इस तरह के उच्च throughput स्क्रीन द्वारा उत्पन्न उन के रूप में बड़े डेटा सेट करने के लिए तराजू, और सही ढंग से जैविक प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर phenotype द्वारा समूह प्रयोगात्मक शर्तों को दिखाया गया है. PhenoBrowser इंटरफ़ेस प्ररूपी अंतरिक्ष की खोज और जैविक एनोटेशन के लिए छवि गुण संबंधित करने के लिए एक सहज ज्ञान युक्त रूपरेखा प्रदान करता है. साथ में ले ली, यहां वर्णित प्रोटोकॉल छवि आधारित स्क्रीन की मात्रात्मक विश्लेषण को गोद लेने के लिए बाधाओं को कम करेगा.

यहाँ हम कार्रवाई के अपने तंत्र पर आधारित समूह दवाओं के लिए इस कार्यप्रवाह की क्षमता का परीक्षण किया. HELA कोशिकाओं 384 अच्छी तरह से थाली के 30 कुओं में वरीयता प्राप्त और डीएनए / actin / α-ट्यूबिलिन के लिए दाग रहे थे....

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

यहाँ हम तेजी से PhenoRipper, एक हाल ही में विकसित छवि विश्लेषण मंच का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों का संग्रह, विश्लेषण और खोज के लिए एक कार्यप्रवाह का वर्णन.

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