Name: rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00
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Damos las gracias a Adam Coster y todos los demás miembros de los laboratorios Altschuler y Wu para la retroalimentación útil y discusiones. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Salud subvenciones R01 GM085442 y CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) y la Fundación Welch I-1619 (SJA) y I-1644 (LFW).

1. Muestras Preparación y Imaging <ol><li> Cultivo celular <ol><li> Dividir culturas rutinaria y mantener al 20-70% de confluencia. Un día antes del experimento, crecer células HeLa en DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco, véase la Tabla de Materiales) y suplementado con 10% de FBS (suero bovino fetal) y 1x penicilina / estreptomicina. </li><li> En el día de experimento, las células de división cada vez mayor en la cultura (alrededor del 50% de confluencia). </li><li> Lavar las células con PBS (tampón fos...

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

El flujo de trabajo aquí descrito permite la caracterización y comparación de imágenes de microscopía fácil y rápido. En primer lugar, demostramos cómo este flujo de trabajo puede ayudar a la optimización de experimento, por ejemplo mediante la realización de controles de calidad de forma rápida en las imágenes de microscopía. A continuación, se demostró su potencial para el análisis de los datos de detección de alto rendimiento: hemos sido capaces de drogas del grupo en función de su mecanismo de acci...

Durante la última década, los rápidos avances en la tecnología de imágenes han dado muchos laboratorios la capacidad de realizar la microscopía de alto rendimiento. Ahora, el reto se ha desplazado de una de las imágenes a una de análisis. ¿Cómo podemos caracterizar, comparar y explorar el torrente de complejos fenotipos aún sutiles generadas por una típica pantalla de proyección de imagen de alto rendimiento? Una serie de análisis de imagen e informática plataformas han dado los usuarios cajas de herramientas sofisticadas 1-3 para la extracción de información biológica de las grandes colecciones de imágenes. Sin embargo, muchos obstáculos persisten importantes en el análisis de los datos de las pantallas basadas en imágenes de alto rendimiento. Las dificultades involucradas con la elección de las caracterizaciones adecuadas de las imágenes y el ajuste fino de los parámetros algorítmicos (para el sistema de interés) a menudo resultan en largos tiempos de preparación, especialmente para los usuarios sin conocimientos de análisis de imagen. En particular, la segmentación de células, el proceso de identificación de células individuales en unimagen n, es un cuello de botella importante en este sentido. La segmentación puede ser altamente sensible a los parámetros experimentales tales como el tipo de células, la densidad celular y bio-marcadores, y con frecuencia requiere ajuste repite para un gran conjunto de datos. Por estas razones, el análisis de imágenes es a menudo un paso independiente, el terminal realizada por especialistas en lugar de una parte integrada del flujo de trabajo experimental. Esto excluye el ciclo de retroalimentación rápida entre el análisis y la experimentación, una parte crucial del desarrollo del ensayo. Aquí se describe un flujo de trabajo alternativo que está optimizado para microscopía de fluorescencia de alto rendimiento y evita muchos de los problemas antes mencionados. Para ello, hacemos uso de PhenoRipper 4, una plataforma de software de código abierto para la exploración y el análisis de imágenes de microscopía rápido. Significativamente, PhenoRipper evita muchos de los desafíos que implica la segmentación celular por no tratar de identificar células individuales. En lugar de ello, PhenoRipper divide las imágenes en píxelesbloques de tamaño subcelular y caracteriza las imágenes en función de los bloques que contienen. Específicamente, PhenoRipper Perfiles de bloques, en términos de funciones de marcador que-a base de colocalización y automáticamente identifica 4 los tipos de bloques más representativos de las imágenes de entrenamiento. PhenoRipper continuación, asigna a cada bloque del tipo de bloque representante más similar, y, finalmente, caracteriza a las imágenes basadas en los tipos de los bloques que contienen. En comparación con los métodos más tradicionales sencillos basados ​​en células, este enfoque requiere sintonía fina mínima y experiencia. Como tal, los usuarios sólo tienen que configurar dos parámetros: el tamaño de bloque y una intensidad umbral (para descartar porciones no celulares de una imagen), ambos de los cuales se establece con información gráfica. Es importante destacar que el flujo de trabajo descrito aquí se ha mostrado 4 de escalar fácilmente a conjuntos de datos mucho más grandes, donde la velocidad y la puesta a punto mínima proporciona gran tiempo y las ganancias de fiabilidad. En la práctica, nos encontramos con que esta aplicacióncucaracha reduce el tiempo necesario tanto para la instalación y funcionamiento de múltiples órdenes de magnitud 4. La salida primaria de PhenoRipper es una representación visual de la imagen de similitud, que permite al usuario para identificar grupos de condiciones experimentales que causan que las células muestran fenotipos similares. Las agrupaciones PhenoRipper encuentra típicamente tienen &quot;interpretabilidad biológica&quot; comparables a los generados por, métodos basados ​​en células que consumen más tiempo 4. En la práctica, esto significa que, a menudo, en menos de media hora de la realización de una típica de 96 pocillos experimento microscopía de fluorescencia, un experimentador sin experiencia de análisis de imagen previa se puede obtener una lectura fiable sobre el rendimiento de su experimento. El experimentador puede entonces comenzar a explorar las relaciones entre las diferentes condiciones experimentales y relacionar estas relaciones con los fenotipos de imagen. Demostramos este flujo de trabajo aquí mediante el análisis de los efectosde medicamentos en clases mecanicistas distintos sobre células HeLa teñidas para marcadores de ADN y del citoesqueleto. Imágenes de las células tratadas con la misma clase de fármacos se agruparon, y las imágenes de mala calidad (artefactos de tinción, de las células de enfoque y así sucesivamente) aparecieron como los valores extremos, haciendo que sean fáciles de identificar y potencialmente descartar. Mientras que este flujo de trabajo es útil para un gran número de ensayos basados ​​en imágenes, está claro que hay muchas situaciones en las que un enfoque diferente podría ser potencialmente más informativo. Por ejemplo, la salida de PhenoRipper es principalmente una comparación relativa de patrones de fluorescencia a través de condiciones experimentales. Si se requiere una caracterización absoluta de un rasgo de células única específica en lugar (por ejemplo, el número de motas en una célula), se requeriría un análisis único-basado en células. Sin embargo, incluso en este tipo de situación, es probable PhenoRipper para detectar cambios en estos fenotipos de una sola célula y por lo tanto ser una herramienta útil para el ensayo de Optimización.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

A pesar de los rápidos avances en microscopía de alto rendimiento, los ensayos basados ​​en imágenes cuantitativos siguen planteando retos importantes. Aunque una variedad de herramientas especializadas de análisis de imagen están disponibles, la mayoría de los flujos de trabajo basados ​​en análisis de imágenes tradicionales tienen empinadas curvas de aprendizaje (para el ajuste fino de los parámetros de análisis) y dan lugar a tiempos de respuesta largos entre las imágenes y el análisis. En particular, la segmentación de células, el proceso de identificación de células individuales de una imagen, es un cuello de botella importante en este sentido. Aquí presentamos un suplente,-segmentación libre de células de flujo de trabajo basado en PhenoRipper, una plataforma de software de código abierto diseñado para el rápido análisis y exploración de imágenes de microscopía. El oleoducto que aquí se presenta está optimizado para imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de cultivos celulares y requiere mínima intervención del usuario. Al cabo de media hora, PhenoRipper puede analizar los datos de un experimento típico de 96 pocillos y generar perfiles de imagen. Los usuarios puedenluego explorar visualmente sus datos, lleve a cabo el control de calidad en su experimento, garantizar una respuesta a las perturbaciones y comprobar la reproducibilidad de repeticiones. Esto facilita un ciclo de retroalimentación rápida entre el análisis y la experimentación, que es crucial durante la optimización de ensayo. Este protocolo es útil no sólo como un análisis de primer paso para el control de la calidad, pero también puede ser utilizado como una solución de extremo a extremo, especialmente para el cribado. El flujo de trabajo descrito aquí se escala para grandes conjuntos de datos, tales como los generados por las pantallas de alto rendimiento, y se ha demostrado al grupo de condiciones experimentales por fenotipo con precisión en una amplia gama de sistemas biológicos. La interfaz PhenoBrowser proporciona un marco intuitiva de explorar el espacio fenotípico y relacionar propiedades de imagen en las anotaciones biológicas. En conjunto, el protocolo descrito aquí bajará las barreras para la adopción de un análisis cuantitativo de las pantallas de imagen basados.

Aquí hemos probado la capacidad de este flujo de trabajo para los medicamentos del grupo en función de su mecanismo de acción. Células HeLa fueron sembradas en 30 pocillos de una placa de 384 pocillos y se tiñeron para ADN / actina / α-tubulina. Los anticuerpos específicos primarios, anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, y otras manchas fluorescentes que fueron utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales. Wells fueron tratados con 15 medicamentos que pertenecen a tres clases mecanicistas (inhib...

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Aquí se describe un flujo de trabajo para el análisis rápido y colecciones de imágenes de microscopía de fluorescencia utilizando PhenoRipper, una plataforma de análisis de imagen recientemente desarrollado explorar.

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

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Research

JoVE Journal

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