Name: rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Vi tackar Adam Coster och alla andra medlemmar i Altschuler och Wu labb för bra återkoppling och diskussioner. Denna forskning stöds av National Institute of Health bidrag R01 GM085442 och CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), och Welch Foundation I-1619 (SJA) och I-1644 (LFW).

1. Förbereda Prover och bildbehandling <ol><li> Cellodling <ol><li> Split kulturer rutinmässigt och hålls kvar vid 20-70% sammanflödet. En dag före experimentet, växa HeLa-celler i DMEM (Dulbeccos modifierade Eagle-medium, se Tabell of Materials) och kompletterat med 10% FBS (fetalt bovint serum), 1x penicillin / streptomycin. </li><li> På dagen för experimentet, dela celler växer i kultur (ca 50% sammanflytande). </li><li> Tvätta cellerna med PBS (fosfatbuffrad saltlösning), utsättas för approximativt 2 ...

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

Arbetsflödet som beskrivs här möjliggör snabb och enkel karakterisering och jämförelse av mikroskopi bilder. Vi visade först hur detta arbetsflöde kan hjälpa experimentera optimering, till exempel genom att snabbt utföra kvalitetskontroll på mikroskopi bilder. Därefter visade vi dess potential för analys av high-throughput screening data: vi skulle kunna gruppera läkemedel baserade på deras verkningsmekanism. Grupperingen av drogerna var jämförbar med den som hittades med användning av mer komplexa met...

Under det senaste årtiondet har snabba utvecklingen inom bildteknik gett många labb förmågan att utföra hög genomströmning mikroskopi. Utmaningen har nu flyttats från en av avbildning till en av analys. Hur kan vi beskriva, jämföra, och utforska torrent av komplexa men ändå subtila fenotyper som genereras av en typisk high-throughput imaging skärm? Ett antal bild-analys och informatikplattformar har gett användarna avancerade verktygslådor 1-3 för att extrahera biologisk information från stora samlingar av bilder. Men många fortfarande stora hinder i att analysera data från high-throughput bildbaserade skärmar. Problem i samband med val av lämpliga beskrivningar av bilder och finjustering av algoritmiska parametrar (till systemet med ränta) resulterar ofta i långa ställtider, särskilt för användare utan bild-analys expertis. Särskilt cell segmentering, processen för identifiering av individuella celler i enn bild, är en stor flaskhals i detta avseende. Segmentering kan vara mycket känsliga för experimentella parametrar som celltyp, celltäthet och bio-markörer, och ofta krävs upprepad justering för en stor datamängd. Av dessa skäl är bildanalys ofta en oberoende, terminala steg som utförs av specialister snarare än en integrerad del av den experimentella arbetsflöde. Detta utesluter snabb återkoppling cykeln mellan analys och experiment, en viktig del av analysutveckling. Här beskriver vi ett alternativt arbetsflöde som är optimerad för hög genomströmning fluorescensmikroskopi och undviker många av de ovannämnda svårigheterna. Därför använder vi oss av PhenoRipper 4, en öppen källkod plattform för snabb undersökning och analys av mikroskopi bilder. Betecknande PhenoRipper undviker många av de utmaningar som med cellsegmentering genom att inte försöka identifiera enskilda celler. Istället PhenoRipper delar in bilden i bildpunktblock av subcellulär storlek och karaktäriserar bilder i termer av de block som de innehåller. Specifikt PhenoRipper profiler block i form av markör-colocalization-baserade funktioner och automatiskt identifierar fyra de mest representativa blocktyper i träningsbilder. PhenoRipper delar sedan till varje block det mest liknande representativa blocket typ, och slutligen präglar bilder baserat på de typer av block som de innehåller. Jämfört med mer traditionella single-cellbaserade metoder, kräver denna metod minimal finjustering och expertis. Som sådan, användarna behöver bara ställa in två parametrar: blockstorlek och en tröskelintensitet (att göra sig icke-cellulär delar av en bild), som båda är inställda med grafisk återkoppling. Huvudsakligen har det arbetsflöde som beskrivs här visats 4 att skala lätt till mycket större datamängder, där hastigheten och minimal finjustering ger stor tid och vinster tillförlitlighet. I praktiken finner vi att denna appmört minskar den tid som krävs både för installation och drift av flera tiopotenser 4. Den primära utmatningen av PhenoRipper är en visuell representation av bildlikhet, vilket möjliggör för användaren att identifiera grupper av försöksbetingelser som orsakar celler att uppvisa liknande fenotyper. Grupperingarna PhenoRipper finner typiskt har jämförbar &quot;biologisk tolkningsbarhet&quot; till de som genereras av mer tidskrävande, cellbaserade metoder 4. I praktiken innebär detta att ofta, inom en halvtimme att utföra en typisk 96-väl fluorescensmikroskopi experiment, en försöksledaren utan tidigare erfarenhet bild-analys kan få en tillförlitlig avläsning om resultatet för sitt experiment. Försöksledaren kan sedan börja utforska sambanden mellan olika experimentella förhållanden och relatera dessa relationer till bild fenotyper. Vi visar detta arbetsflöde här genom att analysera effekternaav läkemedel i olika mekanistiska klasser på HeLa-celler som färgats för DNA och cytoskelettala markörer. Bilder av celler som behandlats med samma klass av läkemedel grupperades tillsammans, och dålig bildkvalitet (färgnings artefakter, ofokuserad celler och så vidare) dök upp som extremvärden, vilket gör dem lätta att identifiera och eventuellt kasta. Även om detta arbetsflöde är användbart för ett stort antal bildbaserade analyser, det finns helt klart många situationer där en annan strategi skulle kunna vara mer informativ. Till exempel är utsignalen från PhenoRipper primärt en relativ jämförelse av fluorescensmönster tvärs experimentella betingelser. Om en absolut karakterisering av en specifik enskild cell drag krävdes i stället (t ex antalet fläckar i en cell), skulle en enda cell-baserade analyser krävas. Men även i denna typ av situation är PhenoRipper sannolikt att upptäcka förändringar i dessa encelliga fenotyper och därför vara ett användbart verktyg för analys optimization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

Trots snabba framsteg inom high-throughput mikroskopi, kvantitativa bildbaserade analyser utgör fortfarande stora utmaningar. Även en mängd specialiserade bild analysverktyg finns tillgängliga, de flesta traditionella bild-analys-baserade arbetsflöden har branta inlärningskurvor (för finjustering av analysparametrar) och leda till långa handläggningstider mellan bildbehandling och analys. Särskilt cell segmentering, processen att identifiera enskilda celler i en bild, är en stor flaskhals i detta avseende. Här presenterar vi en alternativ, cell-segmentefritt arbetsflöde baserad på PhenoRipper, en öppen källkod plattform utformad för snabb analys och utforskning av mikroskopi bilder. Rörledningen som presenteras här är optimerad för immunofluorescens mikroskopi bilder av cellkulturer och kräver minimal användarinblandning. Inom en halvtimme, kan PhenoRipper analysera data från en typisk 96-bra experiment och genererar bildprofiler. Användare kansedan visuellt utforska sina uppgifter, utföra kvalitetskontroll på deras experiment, se svar på störningar och kontrollera reproducerbarhet replikat. Detta underlättar en snabb återkoppling cykel mellan analys och experiment, vilket är avgörande under analysoptimering. Detta protokoll är användbar inte bara som ett första passage-analys för kvalitetskontroll, utan även kan användas som en end-to-end-lösning, speciellt för screening. Arbetsflödet beskrivs här skalor till stora datauppsättningar, såsom de som genereras av hög genomströmning skärmar, och har visats för att gruppera experimentella betingelser genom fenotyp noggrant över ett brett område av biologiska system. Den PhenoBrowser gränssnittet ger en intuitiv ram för att utforska den fenotypiska utrymme och relatera bildegenskaper till biologiska anteckningar. Sammantaget kommer det protokoll som beskrivs här minska hindren för att anta kvantitativ analys av bildbaserade skärmar.

Här vi testade förmågan hos detta arbetsflöde för att gruppera läkemedel baserat på deras verkningsmekanism. HeLa-celler såddes i 30 brunnar i en 384-brunnsplatta och färgades för DNA / aktin / α-tubulin. De specifika primära antikroppar, fluorescensmärkta sekundära antikroppar och andra fluorescenta fläckar som användes är listade i tabell of Materials. Brunnar behandlades med 15 läkemedel som hör till tre mekanistiska klasser (histondeacetylas Hämmare, mikrotubuli inriktade och DNA-skada) under 24 ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Här beskriver vi ett arbetsflöde för att snabbt analysera och utforska samlingar av fluorescens mikroskopi bilder med PhenoRipper, en nyutvecklad bildanalysplattform.

Snabb analys och utforskningen av fluorescensmikroskopi bilder

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitativa levande celler fluorescens-mikroskopi Analys av fissionsjäst

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Ett analysverktyg som kvantifierar cellulär morfologi Ändringar från Tredimensionella fluorescensbilder

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analys av Autophagy med Advanced 3D Fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule frekvens med fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source Hög innehållsanalys Använda automatiserade fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Oligomerisering dynamik cellytan receptorer i levande celler av total inre reflektion fluorescens mikroskopi kombinerat med antal och ljusstyrka analys

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

In situ Utforskning av Murine Megakaryopoiesis med transmissionselektronmikroskopi

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Snabb in vivo-fixering och isolering av translationella komplex från eukaryota celler

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

Fluorescens livstid makrokamera för biomedicinska tillämpningar

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...