Name: activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃŽÂ² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., og Meagan O&#39;Brien, MD for deres støtte og feedback. Denne forskning blev støttet af National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme og afsluttes med støtte fra NIH giver Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards for Individuelle Predoctoral stipendier (F31) for at fremme mangfoldighed i sundhedsrelateret forskning (AI089030) og RO1 (AI081848 ).

Etik Statement: Forskning prøverne tages og opbevares til forskning med donorernes samtykke. Alle prøver skal kodes eller anonymiseret før brug. Denne protokol følger retningslinjerne i vores Institutional Review Board. 1.. Differentiering af humane perifere blod-Monocyter i monocytafledt dendritiske celler. Bemærk: Menneske buffy coats tjene som kilde til humane perifere blodceller (PBMC&#39;er) og blev opnået fra New York Blood Center (New York, NY). Bloddo...

Inflammatoriske cytokiner er integreret i styringen af ​​medfødte og adaptive immunrespons til at bekæmpe virusinfektion. Udskilt IL-1β har vist sig at stige i løbet af influenza-infektion, 3, 43, 44. De præcise mekanismer, hvormed disse cytokiner behandles som reaktion på viral anerkendelse humane dendritiske celler er ikke fuldt forstået. Myeloide DC isolation kits er dyrt og tidskrævende. Isolation kits og FAC sortering kan utilsigtet stress eller aktivere cellerne. Derudover er der ofte utilst...

Aktivering af medfødte immunsystem er nødvendig for at styre adaptive immunrespons under infektion, sygdom og vaccination 7.. Dendritiske celler er de mest potente antigenpræsenterende celler i det medfødte immunsystem; de er specialiseret til optagelse af antigener, migration til lymfeknuder, og aktivering af naive CD4 + og cytolytiske CD8 + T-celler 8-10. For at muliggøre hurtig afsløring patogen det medfødte immunsystem udnytter mange kimlinie kodet mønstergenkendelse receptorer (PRR), der genkender bevaret patogen afledte motiver eller værten afledte markører for celle stress og skader. Toll lignende receptorer (TLRs) er membranbundne mønstergenkendelse receptorer, der genkender visse ekstracellulære phagocytized patogen tilknyttede molekylære mønstre (PAMPs) og fare forbundet molekylære mønstre (dæmper). Derimod nik lignende receptorer (NLRs) er cytosol og reagere på en bred vifte af PAMPs og dæmper. Nik lignende receptorer refremlægge en anden linje i forsvaret mod patogener, der unddrage celleoverfladen og endocytiske PRRs. Samspillet mellem patogen afledt eller &quot;fare&quot; i forbindelse faktorer med TLR og NLR ligander fører til en tilstand af DC-modning resulterer i øget DC samspil med andre immunceller og fremme af T-celle-og killer celle aktivering 11 naturlige. Interleukin-1β er en afgørende komponent i værtens forsvar mod infektion. Ved anerkendelse af en mikroorganisme, det stærkt proinflammatorisk cytokin, IL-1β secerneres og fungerer som et kemo lokkemidler og aktivator af medfødte og adaptive immunceller. In vivo IL-1β er hovedansvarlig for den akutfaserespons herunder feber og inflammatoriske cytokin syntese 12.. De fleste NLRs indeholde en C-terminale leucin rich repeat domæne, der menes at fungere i ligand sensing, en central nukleotid bindingsdomæne (NACHT), som er indførtant for NLRP3 oligomerisering, og en N-terminal effektordomæne (PYD i NLRP3), der medierer signaltransduktion downstream mål gennem protein protein interaktioner. NLRP3 protein definerer mest intenst studerede inflammasome kompleks. Dette protein er et medlem af NLR familien og har evnen til at danne en multi molekylær proteinkompleks består af NLRP3 adapteren protein PYCARD (også kendt som ASC) og ICE. Ved inflammasome aktivering PYCARD binder til NLRP3 N-terminale domæner og rekrutterer ICE via caspaseaktivering og rekruttering domæne (CARD) domæner. Interleukin-1-omdannende enzym indledningsvis genereres som et zymogen indeholdende en CARD motiv ved dets N-terminale ende. Inflammasome dannelse resulterer i at bringe to ICE molekyler tilstrækkelig tæt til at fremkalde deres autokatalytisk aktivering. Inflammasome kompleks er nødvendig for at aktivere ICE hvilket gør det muligt at omdanne cytoplasmisk pro-IL-1β til moden cytokin. Vellykket sekretion af IL-1β i udviklingslandene kræver sensing af to forskellige og uafhængige faresignaler. Først TLR sensing af PAMPs, dæmper eller cytokin signalering (TNFa eller IL-1β) forårsager en opregulering af cytoplasmisk pro-IL-1β-protein-ekspression. Der kræves en anden, ofte anderledes, signal for inflammasome kompleks dannelse opstrøms af ICE modning. Et par inflammasome stimulerende signaler omfatter bakteriemembran poredannende toksiner (såsom nigericin), lysosomale forstyrre krystaller (såsom mononatrium uratkrystaller, MSU) og ekstracellulær ATP. Den opstrøms mekanisme, der fører til NLRP3 inflammasome aktivering af disse forskellige aktivatorer er uklar. Undersøgelser af signalering opstrøms inflammasome dannelse foreslår, at intracellulære begivenheder, såsom induktion af hypokaliæmi eller reaktive ilt arter (ROS) indirekte aktivere inflammasome 13-28. Blandt de forskellige virale aktivatorer af NLRP3 inflammasome er influenza, som giver bAn den primære og sekundære signal kræves for IL-1β sekretion 3, 29-33. Brug af mus NLRP3 knockout modeller blev det fundet, at IL-1β-sekretion i DC&#39;er er NLRP3 afhængig 32. Derudover NLRP3 knockout-mus tiltrak færre leukocytter til stedet for infektion og oplevet højere dødelighed 2, 5. To nylige papirer foreslå en mekanisme til NLRP3 inflammasome aktivering under Influenza virus infektion; første priming gennem anerkendelse af viral RNA ved TLR7 eller TLR8 (afhængigt TLR ekspression af den responderende celle) eller ved detektering af kommensale bakterier af andre TLRs at inducere cytoplasmatisk pro-IL-1β ekspression, efterfulgt af et andet signal, aktivering af NLRP3 inflammasome dannelse af viral ionkanalproteinet M2 på det transeuropæiske Golgi netværket 33, 34. I sidstnævnte trin, der udløser den NLRP3 inflammasome opnås ved forstyrrelse af den intracellulære ioniske &lt;em&gt; miljø, der fører til produktionen af ROS, hvilket er simpelthen, afføles af NLPR3 som et signal til at danne inflammasome. Men den præcise mekanisme af inflammasome aktivering opstrøms af ICE aktivitet under Influenza infektion stadig uklart. Dette arbejde beskriver en teknik værdifuld til at studere NLRP3 inflammasome i menneskelige moDCs, der kan bruges som et fundament for yderligere undersøgelse af vejen bag DC baseret IL-1β sekretion som respons på TLR8 ligatur med R848 efterfulgt af aktivering af inflammasome ved et godt kendt aktivator af NLRP3, nigericin. Variationer af denne fremgangsmåde kan anvendes med andre celletyper, herunder, men ikke begrænset til: monocytter, makrofager, andre DC delmængder og epitelceller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Inflammatoriske processer som følge af udskillelsen af Interleukin (IL) -1 familie cytokiner immunceller føre til lokal eller systemisk inflammation, vævsremodellering og reparation, og virologisk kontrol 1, 2. Interleukin-1β er et væsentligt element i den medfødte immunreaktion og bidrager til at fjerne invaderende patogener samtidig forhindre etableringen af vedvarende infektion 1-5. Inflammasomes er nøglen signalering platform for aktivering af interleukin 1-omdannende enzym (ICE eller Caspase-1). NLRP3 inflammasome kræver mindst to signaler i udviklingslandene til at forårsage IL-1β sekretion 6. Pro-IL-1β-protein ekspression er begrænset i hvilende celler; derfor priming signal er påkrævet til transkription af IL-1β og proteinekspression. Et andet signal registreres af NLRP3 resulterer i dannelsen af ​​multi-protein NLRP3 inflammasome. Evnen af ​​dendritiske celler til ansvard til de signaler, der er nødvendige for IL-1β-sekretion kan testes ved hjælp af en syntetisk purin, R848, som afføles af TLR8 i human monocyt dendritiske celler (moDCs) for at prime celler, efterfulgt af aktivering af NLRP3 inflammasome med det bakterielle toksin og kalium ionofor, nigericin. Monocytafledt DCer let produceres i kultur og give betydeligt flere celler end oprenset humant myeloide udviklingslandene. Metoden præsenteres her adskiller sig fra andre inflammasome assays i, at det bruger humane in vitro, i stedet for mus afledt, DCs således giver mulighed for studiet af inflammasome i human sygdom og infektion.

Disse teknikker måler TLR8 priming med R848. Intracellulær cytokin farvning for pro-IL-1β giver mulighed for mikroskopi og FACS udlæsninger fra CD14 - CD11c + moDCs. Begge teknikker kan kvantificeres i forhold til en ikke-primet eller hvile, cellekontrol samt en isotypekontrol (figur 1 og 2). Procent af pro-IL-1β + farvning af celler multipliceres med den geometriske medianen af denne population for at give den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI). MFI kan sam...

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃŽÂ² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering og måling af NLRP3 Inflammasome Aktivitet hjælp af IL-1β i Human monocytafledte dendritiske celler

Dendritiske celler (DC&#39;er) udskiller IL-1β som reaktion på TLR8 anerkendelse af syntetisk purin, R848, efterfulgt af NLRP3 inflammasome aktivering med nigericin derfor IL-1β kan anvendes til at måle NLRP3 inflammasome aktivitet. Intracellulær cytokin farvning, immunoblotting og ELISA anvendes til præcist at måle NLRP3 inflammasome priming og aktivering via IL-1β udtryk.

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Måling af faktor V aktivitet i humant plasma ved hjælp af en Microplate koagulationsassay

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Samtidig infektion model for at studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions i humane primære Monocytafledte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering af Humane monocytafledte dendritiske celler fra Imaging flowcytometri: en sammenligning mellem to Monocyt Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation of Human monocytafledte dendritiske celler fra fuldblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Udvikling og validering af et Ultrasensitive enkelt molekyle Array Digital enzym-forbundet Immunosorbent Assay for menneskelige Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Kvantificering af Monoyte Chemotaktisk aktivitet in vivo og karakterisering af blod monocytter afledt makrofager

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA elektroporation at Modutere Autophagy i herpes simplex virus type 1-inficerede Monocyte-afledte dendritiske celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro stimulation og visualisering af ekstracellulær fælde frigivelse i differentierede humane monocytter-afledte makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Visualisering af inflammatorisk caspases induceret nærhed i humane monocytafledte makrofager

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Bestemmelse af vaccineimmunogenicitet under anvendelse af bovin monocytafledte dendritiske celler

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...