Name: activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃŽÂ² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., e Meagan O&#39;Brien, MD per il loro supporto e feedback. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive e completato con finanziamenti NIH concede Ruth L. Kirschstein Nazionali servizio di ricerca Awards per i diversi predoctoral Fellowships (F31) per promuovere la diversità nella ricerca in campo sanitario (AI089030) e RO1 (AI081848 ).

Dichiarazione Etica: i campioni di ricerca sono ottenuti e conservati per la ricerca con il consenso dei donatori. Tutti i campioni devono essere codificati o anonimizzati prima dell&#39;uso. Questo protocollo segue le linee guida del nostro Institutional Review Board. 1. Differenziazione del sangue periferico umano monociti in cellule dendritiche derivate da monociti. Nota: buffy coat umani servono come fonte di cellule umane del sangue periferico (PBMC) e sono st...

Citochine infiammatorie sono parte integrante nel guidare la risposta immunitaria innata e adattativa per combattere le infezioni virali. Secreto IL-1β è stato dimostrato di aumentare durante l&#39;infezione influenzale 3, 43, 44. I meccanismi precisi con cui queste citochine sono elaborate in risposta al riconoscimento virale in cellule dendritiche umane non sono pienamente compresi. Kit di isolamento DC mieloidi sono costose e richiedono tempo. Kit di isolamento e FAC ordinamento possono involontariamente...

L&#39;attivazione del sistema immunitario innato è necessario per orientare le risposte immunitarie adattative durante l&#39;infezione, la malattia, e la vaccinazione 7. Le cellule dendritiche sono le più potenti cellule presentanti l&#39;antigene del sistema immune innato; sono specializzati per l&#39;assorbimento di antigeni, la migrazione ai linfonodi, e l&#39;attivazione di ingenuo CD4 + e CD8 + citolitica cellule T 8-10. Per attivare il rilevamento rapido patogeno il sistema immunitario innato utilizza numerosi germinali codificato pattern recognition recettori (PRR), che riconoscono patogeni conservati motivi derivati ​​o ospitano derivata marcatori di stress e danno cellulare. Toll like receptors (TLR) sono recettori di membrana legato pattern recognition che riconoscono certi extracellulare patogeno fagocitato pattern molecolari associati (PAMPs) e modelli molecolari pericolo associato (smorza). Per cenno contrario like receptors (NLRs) sono citosolico e rispondere ad una vasta gamma di PAMPs e smorza. Nod like receptors representare una seconda linea di difesa contro gli agenti patogeni che eludono superficie cellulare e PRRs endocitiche. L&#39;interazione del patogeno derivata o &quot;pericolo&quot; associata, fattori con TLR e NLR ligandi porta ad uno stato di maturazione delle DC conseguente maggiore interazione DC con altre cellule immunitarie e promozione della cellula T e l&#39;attivazione delle cellule natural killer 11. L&#39;interleuchina-1β è una componente cruciale della difesa dell&#39;ospite contro le infezioni. All&#39;atto della rilevazione di un microrganismo, la citochina proinfiammatoria molto, IL-1β, è secreta e funziona come un attrattivo chemio e attivatore delle cellule immunitarie innate e adattative. In vivo IL-1β è in gran parte responsabile della risposta di fase acuta tra cui febbre e citochine infiammatorie sintesi 12. La maggior parte NLRs contengono un dominio ricco di ripetizione C leucina terminale che è pensato per funzionare in sensing ligando, un nucleotide dominio di legame centrale (NACHT), che è imponella documentazione, per NLRP3 oligomerizzazione, ed un terminale di dominio effettore N (PYD in NLRP3) che media la trasduzione del segnale a bersagli a valle attraverso interazioni proteina proteina. La proteina NLRP3 definisce il complesso più intensamente studiati inflammasome. Questa proteina è un membro della famiglia NLR e ha la capacità di formare un complesso proteico molecolare più composto NLRP3, il PYCARD proteina adattatore (noto anche come ASC), e ICE. Dopo l&#39;attivazione inflammasome PYCARD si lega ai domini terminali NLRP3 N e recluta ICE, attraverso l&#39;attivazione delle caspasi e il dominio di reclutamento (CARD) domini. Interleuchina-1 enzima di conversione viene inizialmente generato come zimogeno contenente un motivo CARD al suo N-terminale. Risultati formazione inflammasome nel portare due molecole ICE sufficientemente vicino per indurre la loro attivazione autocatalitica. Il complesso inflammasome necessari all&#39;attivazione ICE permettendo così di convertire citoplasmatica pro-IL-1β maturare citochina. La secrezione di successo di IL-1β in DC richiede rilevamento di due segnali di pericolo diversi e indipendenti. Primo, TLR rilevamento di PAMPs, smorza o segnalazione citochine (TNFa o IL-1β) causa un upregulation dell&#39;espressione della proteina pro-IL-1β citoplasmatica. È necessaria una seconda, spesso diversi, segnale per inflammasome formazione del complesso monte di ICE maturazione. Alcuni inflammasome segnali di stimolare includono le tossine membrana batterica formazione di pori (come nigericin), lisosomiali interrompendo cristalli (come ad esempio cristalli di urato monosodico, MSU), e ATP extracellulare. Il meccanismo che porta a monte NLRP3 attivazione inflammasome da questi diversi attivatori è chiaro. Gli studi che indagano monte segnalazione della formazione inflammasome propone di eventi intracellulari, come l&#39;induzione di ipopotassiemia o di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) indirettamente attivano il inflammasome 13-28. Tra i diversi attivatori virali del inflammasome NLRP3 è influenza, che fornisce bOth il segnale primario e secondario richiesto per la secrezione di IL-1β 3, 29-33. Utilizzando modelli NLRP3 topo knockout è stato trovato che la secrezione di IL-1β in DC è NLRP3 dipendente 32. Inoltre, NLRP3 topi knockout attratti minor numero di leucociti nel sito di infezione e sperimentato una maggiore mortalità 2, 5. Due lavori recenti suggeriscono un meccanismo per l&#39;attivazione inflammasome NLRP3 durante l&#39;infezione da virus influenzale; prima, adescamento attraverso il riconoscimento di RNA virale da TLR7 o TLR8 (seconda espressione TLR della cellula risponde) o tramite rilevamento di batteri commensali da altri TLR per indurre l&#39;espressione citoplasmatica pro-IL-1β, seguito da un secondo segnale, l&#39;attivazione di NLRP3 formazione inflammasome da proteine ​​canale ionico M2 virale sulla rete transeuropea Golgi 33, 34. In quest&#39;ultima fase, l&#39;attivazione del inflammasome NLRP3 è compiuto da disturbi del ionico intracellulare &lt;em&gt; ambiente che porta alla produzione di ROS, che è semplice, rilevata da NLPR3 come segnale per formare il inflammasome. Tuttavia, il meccanismo preciso di inflammasome monte l&#39;attivazione di attività ICE durante l&#39;infezione influenzale rimane ancora poco chiaro. Questo lavoro descrive una tecnica utile per studiare la inflammasome NLRP3 in moDCs umani che può essere utilizzato come base per ulteriori indagini della via sottostante DC basato secrezione di IL-1β in risposta a TLR8 legatura con R848 seguita dall&#39;attivazione del inflammasome da un pozzo attivatore noto di NLRP3, nigericin. Variazioni di questo metodo possono essere utilizzati con altri tipi di cellule inclusi, ma non limitati a: monociti, macrofagi, altri sottoinsiemi DC e cellule epiteliali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Processi infiammatori derivanti dalla secrezione di interleuchina (IL) -1 citochine famiglia di cellule immunitarie portano a infiammazione locale o sistemica, rimodellamento tissutale e riparazione, e il controllo virologico 1, 2. L&#39;interleuchina-1β è un elemento essenziale della risposta immunitaria innata e contribuisce ad eliminare agenti patogeni invasori evitando la creazione di infezione persistente 1-5. Inflammasomes sono la piattaforma chiave di segnalazione per l&#39;attivazione di interleuchina 1 enzima di conversione (ICE o caspasi-1). Il inflammasome NLRP3 richiede almeno due segnali in DC per provocare la secrezione di IL-1β 6. Espressione proteica Pro-IL-1β è limitato in cellule quiescenti; Pertanto è richiesto un segnale di innesco per IL-1β trascrizione e l&#39;espressione della proteina. Un secondo segnale rilevato dai risultati NLRP3 nella formazione del multi-proteina NLRP3 inflammasome. La capacità delle cellule dendritiche di responsabilitàd per i segnali necessari per la secrezione di IL-1β può essere testato utilizzando un purinico sintetico, R848, che è rilevata da TLR8 in monociti umana derivata cellule dendritiche (moDCs) di cellule primarie, seguita da attivazione del inflammasome NLRP3 con la tossina batterica e ionophore potassio, nigericin. Monociti DC derivati ​​vengono facilmente prodotte nella cultura e forniscono significativamente più cellule purificate di cellule dendritiche mieloidi umane. Il metodo qui presentato differisce da altri saggi inflammasome dal fatto di utilizzare in vitro umana, invece di topo derivata, DC permettendo così lo studio della inflammasome nella malattia umana e infezione.

Queste tecniche misurano TLR8 adescamento con R848. Intracellulare colorazione citochina per pro-IL-1β permette di microscopia e FAC letture da CD14 - CD11c + moDCs. Entrambe le tecniche possono essere quantificate rispetto ad un non innescato, o di riposo, controllo delle cellule così come un controllo isotipico (figure 1 e 2). Percentuale di cellule pro-IL-1β + colorazione viene moltiplicato per il mediano geometrico di questa popolazione per fornire l&#39;intensit?...

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Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all&#39;attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

Le cellule dendritiche (DC) secernono IL-1β in risposta al riconoscimento di TLR8 purinico sintetico, R848, seguita dall&#39;attivazione inflammasome NLRP3 con nigericin, dunque, IL-1β può essere utilizzata per misurare l&#39;attività inflammasome NLRP3. Intracellulare colorazione citochina, immunoblotting, ELISA e sono utilizzati per misurare con precisione NLRP3 inflammasome adescamento e l&#39;attivazione tramite l&#39;espressione di IL-1β.

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Misura di attività del Fattore V nel plasma umano usando un saggio di coagulazione Microplate

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Quantificazione dell'attività chemiotatica monocite in vivo e caratterizzazione dei macrofagi derivati monociti del sangue

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

L'elettroporazione di siRNA alla modulazione dell'autofagia nell'herpes Simplex Virus Tipo 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...