Name: activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃŽÂ² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., og Meagan O&#39;Brien, MD for deres støtte og tilbakemeldinger. Denne forskningen ble støttet av National Institute of Allergy and Infectious Disease og gjennomført med midler fra NIH gir Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards for Individual Predoctoral Fellowships (F31) for å fremme mangfold i helsefaglig forskning (AI089030) og RO1 (AI081848 ).

Etikk Uttalelse: Forsknings prøvene er innhentet og lagret for forskning med givernes samtykke. Alle prøver skal kodes eller anonymisert før bruk. Denne protokollen følger retningslinjene til vår Institutional Review Board. En. Differensiering av humane perifere blod monocytter inn stammer fra monocytter dendrittiske celler. Merk: Menneske buffy coats tjene som kilde til humane perifere blodceller (PBMC) og ble hentet fra New York Blood Center (New York, NY). ...

Inflammatoriske cytokiner er integrert i styre medfødte og adaptive immunrespons til å bekjempe virusinfeksjoner. Utskilt IL-1β har vist seg å øke i løpet av influensainfeksjon 3, 43, 44. De nøyaktige mekanismer som disse cytokiner er bearbeidet som respons på viral anerkjennelse i humane dendritiske celler er ikke fullt ut forstått. Myeloid DC isolasjonssett er kostbare og tidkrevende. Isolasjon kits og FAC sortering kan utilsiktet stress eller aktivere cellene. I tillegg er det ofte utilstrekkelig ...

Aktivering av medfødte immunsystemet er nødvendig for å styre adaptive immunresponser under infeksjon, sykdom, vaksinasjon og 7.. Dendrittiske celler er de mest potente antigenpresenterende celler av det medfødte immunsystemet; de er spesialisert for opptak av antigener, migrasjon til lymfeknuter, og aktivering av naive CD4 + og cytolytiske CD8 + T-celler 8-10. For å muliggjøre rask deteksjon av patogen det medfødte immunsystemet benytter mange germline kodet mønstergjenkjenning reseptorer (PRR) som gjenkjenner konservert patogen avledet motiver eller verts avledet markører for celle stress og skade. Toll like reseptorer (TLR) er membran bundet mønstergjenkjenning reseptorer som gjenkjenner visse ekstracellulære phagocytized patogen assosiert molekylære mønstre (PAMPs) og fare forbundet molekylære mønstre (demper). I motsetning nikk like reseptorer (NLRs) er cytosolic og svare på et variert utvalg av PAMPs og demper. Nikke like reseptorer representere en andrelinjeforsvar mot patogener som unndrar celleoverflaten og endocytiske PRRs. Samspillet av patogen avledet, eller &quot;fare&quot; forbundet, faktorer med TLR og NLR ligander fører til en tilstand av DC modning som resulterer i økt DC samhandling med andre immunceller og fremming av T-celle og natural killer celle aktivering 11. Interleukin-1β er en viktig komponent i mange forsvar mot infeksjon. Ved godkjenning av en mikroorganisme, den svært proinflammatoriske cytokiner, IL-1β, utskilles og fungerer som en chemo tiltrekkende og aktivator av medfødte og ervervede immunceller. In vivo IL-1β er i stor grad ansvarlig for den akutte fase respons inkludert feber og inflammatorisk cytokin syntese 12. De fleste NLRs inneholde en C-terminal leucine rikt gjenta domene som er tenkt å fungere i ligand sensing, en sentral nucleotide bindende domenet (NACHT) som er important for NLRP3 oligomerization, og en N-terminal effektor domene (PYD i NLRP3) som medierer signaltransduksjon til nedstrøms mål gjennom protein protein interaksjoner. NLRP3 protein definerer de mest intenst studert inflammasome kompleks. Dette proteinet er et medlem av familien NLR og har evnen til å danne et multi molekylproteinkompleks bestående av NLRP3, adapteren protein PYCARD (også kjent som ASC), og is. Ved inflammasome aktivering PYCARD binder seg til NLRP3 I terminal domener og rekrutterer ICE via caspase aktivering og rekruttering domene (kort) domener. Interleukin-1-konverterende enzym blir først generert som et zymogenplasminogen.Plasminogen inneholdende et CARD motiv ved dets N-terminus. Inflammasome dannelsen, resulterer i å bringe to is molekyler tilstrekkelig tett til å indusere deres autokatalytisk aktivering. Den inflammasome kompleks som er nødvendig for aktivering av ICE og dermed tillater det å konvertere cytoplasmisk pro-IL-1β å modne cytokin. Vellykket sekresjon av IL-1β i DCs krever sensing av to ulike og uavhengige faresignaler. Først, TLR sensing av PAMPs, demper, eller cytokin signalering (TNF-alfa eller IL-1β) fører til en oppregulering av cytoplasmatisk pro-IL-1β protein uttrykk. En annen, ofte annerledes, signal er nødvendig for inflammasome kompleksdannelse oppstrøms for ICE modning. Noen inflammasome stimulerende signaler omfatter bakterielle membran poredannende toksiner (som nigericin), lysosomale forstyrre krystaller (for eksempel mononatrium urat krystaller, MSU), og ekstracellulært ATP. Oppstrøms mekanisme som fører til NLRP3 inflammasome aktivering av disse ulike aktivatorer er uklart. Studier som undersøker signaliserer oppstrøms inflammasome dannelse foreslår at intracellulære hendelser, for eksempel induksjon av hypokalemi eller reaktive oksygenforbindelser (ROS) indirekte aktivere inflammasome 13-28. Blant de forskjellige virale aktivatorer av den NLRP3 inflammasome er influensa, som gir bOTH den primære og sekundære signal kreves for IL-1β sekresjon 3, 29-33. Ved hjelp av muse NLRP3 knockout modeller ble det funnet at IL-1β sekresjon i DCs er NLRP3 avhengig 32. I tillegg NLRP3 knockout mus tilt færre leukocytter til området for infeksjon og opplevde høyere dødelighet 2, 5. To nyere papirer foreslå en mekanisme for NLRP3 inflammasome aktivering under Influensa virus infeksjon; først grunning gjennom anerkjennelse av viralt RNA ved TLR7 eller TLR8 (avhengig TLR ekspresjon av det reagerer celle) eller ved avføling av Commensal bakterier ved andre TLR å indusere cytoplasmisk pro-IL-1β ekspresjon, fulgt av et andre signal, aktivering av NLRP3 inflammasome dannelsen av viral ionekanal protein M2 på trans Golgi nettverk 33, 34. I det sistnevnte trinn, er utløsning av den NLRP3 inflammasome oppnådd ved forstyrrelse av intracellulær ionisk &lt;em&gt; miljø som fører til ROS produksjon, noe som er ganske enkelt, som avføles av NLPR3 som et signal for å danne det inflammasome. Men den nøyaktige virkningsmekanismen inflammasome aktivering oppstrøms ICE aktivitet under influensainfeksjon er fremdeles uklart. Dette arbeidet beskriver en teknikk verdifullt for å studere NLRP3 inflammasome i menneskelige moDCs som kan brukes som et grunnlag for videre etterforskning av veien underliggende DC basert IL-1β sekresjon i respons til TLR8 ligation med R848 fulgt av aktivering av inflammasome av et godt kjent aktivator av NLRP3, nigericin. Variasjoner av denne fremgangsmåte kan anvendes sammen med andre celletyper, inkludert, men ikke begrenset til, monocytter, makrofager, andre DC-undergrupper, og epitelceller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Inflammatoriske prosesser som følge av utskillelsen av interleukin (IL) -1 familien av cytokiner immunceller fører til lokal eller systemisk inflammasjon, vev-omdanning og reparasjon, og virologisk kontroll 1, 2. Interleukin-1β er et vesentlig element i det medfødte immunforsvaret og bidrar til å eliminere invaderende patogener mens hindre etablering av vedvarende infeksjon 1-5. Inflammasomes er nøkkelsignale plattformen for aktivering av interleukin 1-konverterende enzym (ICE eller Caspase-1). Den NLRP3 inflammasome trengs minst to signaler i DCS å forårsake IL-6 sekresjon 1β. Pro-IL-1β protein ekspresjon er begrenset i hvilende celler; derfor en tennsignal er nødvendig for IL-1β transkripsjon og proteinekspresjon. Et andre signal som avføles av NLRP3 resulterer i dannelsen av multi-protein NLRP3 inflammasome. Muligheten av dendrittiske celler til ansvard til de signaler som er nødvendige for IL-1β sekresjon kan testes ved hjelp av en syntetisk purin, R848, som blir avfølt av TLR8 i human monocytt avledet dendrittiske celler (moDCs) å prime-celler, etterfulgt av aktivering av NLRP3 inflammasome med bakterielle toksiner og kalium ionophore, nigericin. Som stammer fra monocytter DCs er lett produsert i kultur og gi betydelig flere celler enn rensede menneske myeloide DCs. Metoden som er presentert her er forskjellig fra andre inflammasome assays ved at den bruker in vitro human, i stedet for mus avledet, DC og dermed gir for studiet av inflammasome i human sykdom og infeksjon.

Disse teknikkene måle TLR8 grunning med R848. Intracellulær cytokin farging for pro-IL-1β åpner for mikroskopi og FACS avlesninger fra CD14 - CD11c + moDCs. Begge teknikkene kan kvantifiseres i forhold til en ikke fylt, eller hviler, cellekontroll, så vel som en isotype-kontroll (figur 1 og 2). Prosent av pro-IL-1β + fargings celler er multiplisert med den geometriske midtlinje av denne populasjon for å gi median fluorescensintensitet (MFI). MFI er sammenlignbar m...

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃŽÂ² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivisering og måling av NLRP3 Inflammasome aktivitet Bruke IL-1β i Human Monocyte-avledet dendrittiske celler

Dendrittiske celler (DCS) skiller ut IL-1β som reaksjon på TLR8 anerkjennelse av syntetisk purin, R848, etterfulgt av NLRP3 inflammasome aktivering med nigericin derfor IL-1β kan brukes til å måle NLRP3 inflammasome aktivitet. Intracellulær cytokin farging, immunoblotting, og ELISA brukes til å måle NLRP3 inflammasome grunning og aktivering via IL-1β uttrykk.

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Måling av Faktor V aktivitet i Human Plasma Ved hjelp av en Microplate koagulasjon Assay

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infeksjon modell for å studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 interaksjoner i Human Primary monocytt-deriverte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler ved Imaging flowcytometrisystemer: En sammenligning mellom to Monocyte Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler fra Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Utvikling og validering av en Ultrasensitive ett molekyl Array Digital enzym knyttet Immunosorbent analysen for menneskelig Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Kvantifisering av monocytt chemotactic aktivitet in vivo og karakterisering av Blood monocytt avledet makrofager

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA electroporation til modulere Autofagi i herpes simplex virus type 1-infiserte monocytt-avledet dendrittiske celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro stimulering og visualisering av ekstracellulære Trap Release i differensiert Human monocytt-avledet makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Visualisering av inflammatoriske caspaser indusert nærhet i humane monocytt-avledede makrofager

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Bestemmelse av vaksineimmunogenisitet ved bruk av dendrittiske celler fra bovint monocytt

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...