Name: activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃŽÂ² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., e Meagan O&#39;Brien, MD, pelo apoio e feedback. Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e concluído com financiamento do NIH concede Ruth L. Kirschstein Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa para individuais predoctoral Fellowships (F31) para promover a diversidade na Pesquisa em Saúde Relacionados (AI089030) e SR1 (AI081848 ).

Declaração de Ética: Amostras de pesquisa são obtidos e armazenados para pesquisa com o consentimento dos doadores. Todas as amostras devem ser codificadas ou anónimos, antes da utilização. Este protocolo segue as diretrizes do nosso Conselho de Revisão Institucional. 1. Diferenciação de monócitos do sangue periférico em células dendríticas derivadas de monócitos. Nota: cremes leucocitários humanos servir como fonte de células do sangue periférico...

As citocinas inflamatórias são essenciais na condução da resposta imune inata e adaptativa para combater a infecção viral. Secretado IL-1β tem sido demonstrado que o aumento durante a infecção da gripe 3, 43, 44. Os mecanismos exactos pelos quais essas citocinas são processados, em resposta ao reconhecimento viral em células dendríticas humanas não são completamente compreendidos. Mielóides kits de isolamento DC são caros e demorados. Kits de isolamento e FAC classificação pode involuntariam...

A ativação do sistema imune inato é necessário para orientar as respostas imunes adaptativas durante a infecção, doença e vacinação 7. As células dendríticas são o antigénio mais potente que apresenta as células do sistema imune inato; eles são especializados para a absorção de antígenos, a migração para os gânglios linfáticos, e ativação de ingênuo CD4 + e as células T CD8 + citolítica 8-10. Para permitir a detecção de patógenos rápida do sistema imune inato utiliza inúmeros receptores de reconhecimento padrão germinativas codificado (PRR) que reconhecem patógenos conservada motivos derivados ou host derivado marcadores de estresse celular e danos. Toll like receptors (TLRs) são receptores de reconhecimento padrão membrana ligada que reconhecem determinado patógeno fagocitada extracelular padrões associados moleculares (PAMPs) e padrões moleculares de perigo associado (amortece). Ao aceno contraste como receptores (NLRs) são citosólica e responder a uma gama diversificada de PAMPs e DAMPs. Nod like receptors reapresentar uma segunda linha de defesa contra patógenos que escapam da superfície celular e PRRs endocíticas. A interação do patógeno derivada, ou &quot;perigo&quot; associado, fatores com TLR e NLR ligantes leva a um estado de maturação DC resultando em aumento da interação DC com outras células do sistema imunológico e na promoção de células T e ativação das células natural killer 11. Interleucina-1β é um componente crucial da defesa do hospedeiro contra a infecção. Mediante o reconhecimento de um microrganismo, a citoquina altamente pró-inflamatória IL-1β, é segregada e funciona como um atractivo químico e activador de células imune inata e adaptativa. In vivo de IL-1β é em grande parte responsável pela resposta de fase aguda, incluindo febre e citocinas inflamatórias síntese 12. A maioria dos NLRs conter uma leucina do terminal C rico domínio de repetição que é pensado para funcionar na detecção do ligando, um domínio de ligação de nucleótido central (NACHT) que é important para NLRP3 oligomerização e um domínio efetor terminal de N (PYD em NLRP3) que medeia a transdução de sinal para alvos a jusante através de interações proteína proteína. A proteína NLRP3 define o complexo inflammasome mais intensamente estudado. Esta proteína é um membro da família NLR e tem a capacidade de formar um complexo de proteína molecular de vários compostos de NLRP3, o PYCARD proteína adaptadora (também conhecido como ASC), e ICE. Após a ativação inflammasome PYCARD liga a domínios terminais NLRP3 N e recruta ICE via ativação da caspase e domínio de recrutamento (cartão) domínios. A interleucina-1 da enzima de conversão é inicialmente gerado como um zimogénio que contém um motivo CARTÃO na sua extremidade N-terminal. Resultados de formação inflammasome em trazer duas moléculas ICE suficientemente perto para induzir sua ativação autocatalítica. O complexo inflammasome é necessário para activação de ICE, assim permitindo que a converter citoplasmática pró-IL-1β para amadurecer citocina. Secreção de IL sucedida-1β em DCs requer detecção de dois sinais diferentes e independentes de perigo. Primeiro, TLR detecção de PAMPs, DAMPs, ou sinalização de citocinas (TNF ou IL-1β) provoca uma regulação positiva da expressão citoplasmática de proteínas pró-IL-1β. Uma segunda, muitas vezes diferentes, o sinal é necessário para a formação do complexo inflammasome a montante de maturação ICE. Alguns inflammasome estimulando sinais incluem poros da membrana bacteriana formando toxinas (como nigericina), lisossomais interromper cristais (tais como cristais de urato monossódico, MSU) e ATP extracelular. O mecanismo montante levando a ativação NLRP3 inflammasome por esses diversos ativadores não é clara. Estudos investigando sinalizando a montante da formação inflammasome propõe que os eventos intracelulares, tais como a indução da hipocalemia ou espécies reativas de oxigênio (ROS) indiretamente ativar o inflammasome 13-28. Entre os diferentes activadores virais do inflammasome NLRP3 é gripe, que fornece both o sinal primário e secundário necessário para a secreção de IL-1β 3, 29-33. Usando modelos de mouse NLRP3 knockout verificou-se que a secreção de IL-1β em DCs é NLRP3 dependente 32. Além disso, ratinhos knockout Nlrp3 atraído menor número de leucócitos para o local da infecção e experimentaram maior mortalidade 2, 5. Dois artigos recentes sugerem um mecanismo para a ativação inflammasome NLRP3 durante a infecção pelo vírus Influenza; em primeiro lugar, por meio de priming reconhecimento de ARN viral por TLR7 TLR8 ou (dependendo expressão TLR da célula responder) ou através de detecção de bactérias comensais por outro TLR para induzir a expressão citoplasmática pró-IL-1β, seguido por um segundo sinal, a activação de NLRP3 formação inflammasome pela proteína de canal iônico viral M2 na rede de Golgi trans 33, 34. No último passo, o desencadeamento de inflammasome NLRP3 é realizado por perturbação do intracelular iónico &lt;in&gt; meio que conduz a produção de ROS, que é, simplesmente, detectada por NLPR3 como um sinal de modo a formar o inflammasome. No entanto, o mecanismo preciso de inflammasome montante activação de actividade da ICE durante a infecção da gripe ainda permanece incerto. Este trabalho descreve uma técnica valiosa para o estudo da inflammasome NLRP3 em moDCs humanos que pode ser usado como uma base para uma investigação mais aprofundada da via subjacente DC baseado secreção de IL-1β em resposta a TLR8 ligadura com R848 seguido pela ativação do inflammasome por um bem activador conhecido de NLRP3, nigericina. Variações deste método pode ser usado com outros tipos de células, incluindo, mas não limitados a: monócitos, macrófagos, outros subconjuntos DC, e células epiteliais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Processos inflamatórios resultantes da secreção de interleucina (IL) -1 citocinas família de células do sistema imunológico levar à inflamação local ou sistêmica, remodelação e reparação tecidual e controle virológico 1, 2. Interleucina-1β é um elemento essencial da resposta imune inata e contribui para eliminar agentes patogénicos invasores, evitando a criação de uma infecção persistente 1-5. Inflammasomes são a plataforma de sinalização fundamental para a ativação da enzima conversora de interleucina 1 (ICE ou Caspase-1). O inflammasome NLRP3 requer, pelo menos, dois sinais em DCs para provocar a secreção de IL-6 1β. A expressão da proteína pro-IL-1β é limitado em células em repouso; Por conseguinte, um sinal de iniciação é necessária para a transcrição IL-1β e a expressão da proteína. Um segundo sinal detectado pelo Nlrp3 resultados na formação do NLRP3 inflammasome multi-proteína. A capacidade das células dendríticas que respond para os sinais requeridos para a secreção de IL-1β pode ser testado utilizando uma purina sintético, R848, que é detectada por TLR8 em monócitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) de células principais, seguido de activação da inflammasome NLRP3 com a toxina bacteriana e ionóforo de potássio, nigericina. DCs derivadas de monócitos, são facilmente produzidas em cultura e fornecer um número significativamente maior do que as células purificadas DCs mielóides humanos. O método aqui apresentado difere de outros ensaios inflammasome em que ele usa em humanos in vitro, em vez de ratinho derivada, permitindo assim DCs para o estudo da inflammasome na doença humana e infecção.

Estas técnicas medir TLR8 priming com R848. Coloração citocina intracelular para pró-IL-1β permite a microscopia e FACS leituras de CD14 - CD11c + moDCs. Ambas as técnicas podem ser quantificados em relação a um não carregadas, ou de descanso, controlo de células, bem como um controlo do isotipo (Figuras 1 e 2). Percentagem de células pró-IL-1β + coloração é multiplicado pela média geométrica da população para fornecer a intensidade de fluorescência ...

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Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

As células dendríticas (CDs) segregam IL-1β em resposta ao reconhecimento de purina TLR8 sintético, R848, seguido por activação inflammasome NLRP3 com nigericina, por conseguinte, a IL-1β pode ser utilizado para medir a actividade inflammasome NLRP3. Coloração intracelular de citocinas, immunoblotting e ELISA são usados ​​para medir com precisão NLRP3 inflammasome priming e ativação via expressão de IL-1β.

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Medição da actividade de factor V no plasma humano, utilizando um ensaio de coagulação de Microplacas

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Imunologia e Infecção

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Quantificação da atividade quimiotática de monócitos in vivo e caracterização de macrófagos derivados de monócitos sanguíneos

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

eletroporação siRNA para modular a autofagia em herpes simplex vírus tipo 1 infectado monocyte derivados células dendríticas

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...