Name: activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃŽÂ² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Авторы хотели бы выразить признательность Оливье Manches, доктор философии, Давор Frleta, доктор философии, и Меган О&#39;Брайен, MD за их поддержку и обратную связь. Это исследование было поддержано Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний и завершил с финансированием от NIH предоставляет Рут L. Kirschstein Национальный исследовательский Сервис наград для отдельных Predoctoral стипендий (F31) поощрять разнообразие в связанных со здоровьем исследований (AI089030) и RO1 (AI081848 ).

Заявление по этике: образцы исследований получены и сохранены для исследования с согласия донора. Все образцы должны быть закодированы или анонимными перед использованием. Этот протокол следует руководству нашей Institutional Review Board. 1. Дифференциация периферической крови че...

Воспалительные цитокины являются неотъемлемой в рулевое врожденную и адаптивный иммунный ответ, чтобы бороться вирусную инфекцию. Выделяется Ил-1β было показано, что увеличение во время гриппа инфекции 3, 43, 44. Точные механизмы, с помощью которых эти цитокины, обработанные в ответ...

Активация иммунной системы требуется, чтобы направить адаптивного иммунного ответа во время инфекции, болезней и вакцинации 7. Дендритные клетки являются наиболее мощным антиген представляющих клеток врожденной иммунной системы; они специализируются на поглощение антигенов, миграции в лимфатические узлы, и активации наивного CD4 + и цитолитический CD8 + Т-клеток 8-10. Чтобы включить быстрое обнаружение патогена врожденной иммунной системы использует многочисленные зародышевые кодируется рецепторы распознавания образов (ПРР), которые признают консервативный патогенных полученные мотивы или хост получены маркеры стресса и повреждения клеток. Toll подобные рецепторы (TLR,) являются мембранные связаны рецепторы распознавания образов, которые признают определенную внеклеточный фагоцитируются патоген, связанные молекулярные паттерны (PAMPs) и опасность, связанная молекулярные паттерны (DAMPS). В отличие от кивком, как рецепторов (NLRS) являются цитозольный и отвечать разнообразных PAMPs и DAMPS. Nod подобные рецепторы повторнопредставить вторую линию обороны против патогенов, которые уклоняются поверхность клеток и эндоцитотических PRRS. Взаимодействие возбудителя, полученных или «опасности» ассоциируется, факторы с TLR и РНБ лигандов приводит к состоянию постоянного созревания в результате усиления взаимодействия постоянного тока с другими иммунными клетками и продвижения Т-клеток и активации естественных клеток-киллеров 11. Интерлейкина-1β является одним из важнейших компонентов в защите организма против инфекции. После признания микроорганизма, высоко провоспалительных цитокинов IL-1β, секретируется и функционирует как химио аттрактанта и активатора врожденной и адаптивной иммунных клеток. В естественных условиях ИЛ-1β в значительной степени ответственна за ответ острой фазы в том числе лихорадки и цитокина Синтез 12. Большинство NLRS содержать C терминал лейцин богатый домен повтора, как полагают, функционируют в лиганда зондирования, центральной нуклеотидной связывающего домена (Nacht), который ИМПОrtant для NLRP3 олигомеризации, и N концевого домена эффекторной (PYD в NLRP3), который опосредует передачу сигнала в нижестоящих мишеней через белковые белковых взаимодействий. Белок Nlrp3 определяет наиболее интенсивно изучал inflammasome комплекс. Этот белок является членом семьи NLR и имеет возможность сформировать мульти молекулярного комплекса белка, состоящего из NLRP3, в PYCARD адаптер белка (также известный как ASC) и ICE. По inflammasome активации PYCARD связывается с Nlrp3 N терминальных доменов и нанимает ICE посредством активации каспазы и области найма (CARD) областей. Интерлейкин-1-превращающего фермента первоначально генерируется как зимогена, содержащей карту мотив на его N-конце. Inflammasome результаты формирования в результате чего две молекулы ICE достаточно близко, чтобы побудить их автокаталитическую активации. Inflammasome комплекс необходим для активации ICE что позволяет ему конвертировать цитоплазматический про-IL-1β, чтобы созреть цитокин. Успешное выделение IL-1β в РС требуется зондирование двух разных и независимых сигналов опасности. Во-первых, TLR зондирование PAMPs, DAMPS или сигнализации цитокинов (ФНО или IL-1β) вызывает позитивную регуляцию цитоплазматической экспрессии про-IL-1β белка. Второй, часто отличаются, сигнал необходим для inflammasome комплексообразования вверх по течению от ICE созревания. Несколько inflammasome стимулирования сигналы включают образующие токсины бактерий мембрана пор (например, нигерицина), лизосомальные нарушения кристаллы (например, мононатрия уратов кристаллов, МГУ), и внеклеточный АТФ. Вверх по течению механизм, приводящий к NLRP3 inflammasome активацию этих разнообразных возбудителей непонятно. Исследования следственные сигнализации вверх по течению inflammasome образования предлагает, чтобы внутриклеточные события, такие как индукции гипокалиемии или активных форм кислорода (АФК) косвенно активировать inflammasome 13-28. Среди различных вирусных возбудителей в inflammasome NLRP3 является гриппа, который обеспечивает бВ противном первичный и вторичный сигнал, необходимый для Ил-1β секреции 3, 29-33. Использование модели мыши с нокаутом NLRP3 было обнаружено, что IL-1β в ДК секреции является NLRP3 зависит 32. Кроме того, мышей нокаутом NLRP3 привлекает меньше лейкоцитов в очаге инфекции и наблюдается повышение смертности 2, 5. Два недавних работах предложить механизм для активации inflammasome NLRP3 во время гриппа вирусной инфекции; Сначала грунт через признание вирусной РНК с помощью TLR7 или TLR8 (в зависимости от экспрессии TLR отвечающего клетки), либо через зондирования синантропных бактерий другими TLRs индуцировать цитоплазматическую про-IL-1β экспрессию, с последующим вторым сигналом активации, NLRP3 inflammasome образование по вирусного белка ионного канала М2 на транс Гольджи сети 33, 34. В последнем шаге, срабатывание inflammasome NLRP3 осуществляется нарушения внутриклеточного ионного &lt;EM&gt; среда приводит к продукции АФК, который является, просто, воспринимается NLPR3 как сигнал, чтобы сформировать inflammasome. Тем не менее, точный механизм inflammasome активации верховьях ICE деятельности в течение гриппа инфекции все еще остается неясным. Эта работа описывает технику ценную для изучения NLRP3 inflammasome в человеческих moDCs который может быть использован в качестве основы для дальнейшего изучения пути, лежащей в основе DC основе секреции ИЛ-1β в ответ на TLR8 перевязки с R848 с последующим активации inflammasome по хорошо Известно, активатор NLRP3, нигерицин. Вариации этого метода могут быть использованы с другими типами клеток, включая, но не ограничиваясь ими: моноциты, макрофаги, других подмножеств постоянного тока и эпителиальных клеток.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Воспалительные процессы, возникающие в результате секреции интерлейкина (IL) -1 семьи цитокины иммунными клетками привести к локальной или системного воспаления, ремоделирования ткани и ремонта, а также контроля вирусологического 1, 2. Интерлейкина-1β является важным элементом врожденного иммунного ответа и способствует устранению вторжение болезнетворных микроорганизмов, предотвращая создание хронической инфекции 1-5. Inflammasomes являются ключом сигнализации платформа для активации интерлейкина 1 превращающего фермента (ICE или каспазы-1). Nlrp3 inflammasome требуется не менее двух сигналов в ДК, чтобы вызвать Ил-1β секрецию 6. Экспрессия белка Pro-IL-1β ограничен в покоящихся клеток; поэтому сигнал грунтовки требуется для IL-1β транскрипции и экспрессии белка. Второй сигнал считывается результатов NLRP3 в формировании нескольких белков NLRP3 inflammasome. Способность дендритных клеток в респонденD на сигналы, необходимые для секреции IL-1β может быть проверена с использованием синтетического пурин, R848, который воспринимается TLR8 в человеческой моноцитов дендритных клеток (moDCs) в первичных клетках, а затем активацией inflammasome NLRP3 с бактериальным токсином и ионофор калия, нигерицин. Моноцитов, полученные ДК легко получены в культуре и обеспечивают значительно больше клеток, чем очищенных человеческих миелоидных ДК. Метод, представленный здесь отличается от других анализов inflammasome в том, что он использует в пробирке человека, а мыши, полученной, таким образом позволяя ДК для изучения inflammasome в человеческой болезни и инфекции.

Эти методы измерения TLR8 заливке с R848. Внутриклеточного цитокина окрашивание на про-IL-1β позволяет микроскопии и Facs показаний от CD14 - CD11c + moDCs. Оба метода могут быть количественно относительно к не загрунтованных или отдыха, контроль клеточного, а в качестве контрольного изоти...

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃŽÂ² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Активация и Измерение NLRP3 Inflammasome деятельности Использование IL-1β в человека моноцитов дендритные клетки

Дендритные клетки (ДК) секретируют IL-1β в ответ на распознавание TLR8 синтетического пурин, R848, с последующей активацией inflammasome NLRP3 с нигерицина, следовательно, IL-1β может быть использован для измерения активности inflammasome NLRP3. Внутриклеточного цитокина окрашивание, иммуноблотинга и ИФА используются для точного измерения NLRP3 inflammasome грунтования и активация через выражение ИЛ-1β.

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Измерение активности фактора V в плазме крови человека с помощью анализа микропланшетов коагуляции

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; В пробирке</em&gt; Ко-инфекция моделью для изучения<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; ВИЧ-1 Взаимодействие человека в первичной моноцитарных иммунных клеток

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Характеристика человека моноцитов дендритные клетки путем обработки изображений проточной цитометрии: Сравнение между двумя моноцитов Isolation протоколов

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Поколение человеческих моноцитов дендритных клеток из цельной крови

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Разработка и валидация сверхчувствительная одной молекулы массив цифровых энзим соединенный Assay иммуносорбента для человеческий интерферон α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Количественная оценка моноцитной хемотаксической активности in Vivo и характеристика кровяных моноцитов, полученных макрофагами

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA Электропорация модулировать аутофагии в вирусе простого герпеса типа 1-инфицированных моноцитов производные дендритные клетки

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

В экстракорпоральная стимуляция и визуализация внеклеточной ловушки релиз в дифференцированных человеческих моноцитов полученных макрофагов

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Визуализация воспалительных каспаз, индуцированных близостью в макрофагах, полученных из моноцитов человека

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Определение иммуногенности вакцины с использованием дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...