Name: activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃŽÂ² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Författarna vill tacka för Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., och Meagan O&#39;Brien, VD för deras stöd och feedback. Denna forskning stöds av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar och avslutade med finansiering från NIH bidrag Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards för enskilda predoctoral stipendier (F31) för att främja mångfald i Hälsorelaterade forskning (AI089030) och RO1 (AI081848 ).

Etik Uttalande: Forskningsprov erhålls och lagras för forskning med givarnas samtycke. Alla prover bör kodas eller anonymiseras före användning. Detta protokoll följer riktlinjerna i vår Institutional Review Board. 1. Differentiering av humana perifera blod Monocyter in Monocyte härledda dendritiska celler. Obs: Mänskliga buffy coats tjäna som källa till humana perifera blodceller (PBMC) och erhölls från New York Blood Center (New York, NY). Blodgivare...

Inflammatoriska cytokiner är integrerad i styrningen av medfödda och adaptiva immunförsvaret att bekämpa virusinfektion. Utsöndrad IL-1β har visats öka under influensainfektion 3, 43, 44. De exakta mekanismerna genom vilka dessa cytokiner bearbetas som svar på viral erkännande i humana dendritiska celler är inte helt klarlagda. Myeloid DC isolering kit är dyrt och tidskrävande. Isolation kit och FAC sortering kan oavsiktligt stress eller aktivera cellerna. Dessutom finns det ofta otillräcklig mä...

Aktivering av medfödda immunsystemet krävs för att styra adaptiva immunsvaret vid infektion, sjukdom och vaccination 7. Dendritiska celler är de mest potenta antigenpresenterande celler av det medfödda immunsystemet; De är specialiserade för upptag av antigener, migration till lymfkörtlar, och aktivering av naiva CD4 + och cytolytiska CD8 + T-celler 8-10. För att möjliggöra snabb upptäckt patogen det medfödda immunsystemet utnyttjar många könsceller kodad mönsterigenkänningsreceptorer (PRR) som känner igen bevarade patogen härrör motiv eller värd härrör markörer för cell stress och skador. Toll liknande receptorer (TLRs) är membranbundna mönsterigenkännings receptorer som känner igen vissa cellulära fagocytiserade patogener associerade molekylära mönster (PAMPs) och fara molekylära mönster (dämpas). Däremot nicka liknande receptorer (NLRs) är cytosoliskt och svara på en rad olika PAMPs och dämpar. Nicka liknande receptorer relägga fram en andra försvarslinje mot patogener som undgå cellytan och endocytiska PRRs. Interaktionen av patogenen härleds, eller &quot;fara&quot; associerat, faktorer med TLR och NLR ligander leder till ett tillstånd av DC-mognad leder till ökad DC interaktion med andra immunceller och främjande av T-cell-och naturliga mördarcellaktivering 11. Interleukin-1β är en avgörande komponent i infektionsförsvaret. Vid erkännande av en mikroorganism, den starkt proinflammatoriska cytokiner, IL-1β, utsöndras och fungerar som en cellgifter lockmedel och aktivator av medfödda och adaptiva immunceller. In vivo IL-1β är till stor del ansvarig för den akuta fasen svaret inklusive feber och inflammatoriska cytokiner syntes 12. De flesta NLRs innehålla en C-terminal leucin-rika upprepningsdomän som är tänkt att fungera i ligand-avkänning, en central nukleo-bindningsdomän (NACHT) som är important för NLRP3 oligomerisering, och en N terminal effector domain (PYD i NLRP3) som medierar signaltransduktion till mål nedströms genom protein-proteininteraktioner. NLRP3 proteinet definierar mest intensivt studerade inflamma komplex. Detta protein är en medlem av NLR familjen och har förmågan att bilda en multi molekylproteinkomplex bestående av NLRP3, adapterprotein PYCARD (även känd som ASC) och is. Vid inflamma aktivering PYCARD binder till NLRP3 N terminalområden och rekryterar ICE via kaspasaktivering och rekryteringsdomän (CARD) domäner. Interleukin-1-omvandlande enzym initialt genererad som en zymogen innehållande en CARD-motivet vid dess N-terminal. Inflammabildning leder föra två ICE molekyler tillräckligt nära för att framkalla deras autokatalytisk aktivering. Det inflamma komplex är nödvändigt för att aktivera ICE vilket gör det möjligt att omvandla cytoplasmatisk pro-IL-1β att mogna cytokin. Framgångsrik sekretion av IL-1β i utvecklingsländer kräver avkänning av två olika och oberoende varningssignaler. Först TLR avkänning av PAMPs, dämpar, eller cytokin signalering (TNF eller IL-1β) orsakar en uppreglering av cytoplasma pro-IL-1β proteinuttryck. En andra, ofta olika, signalen krävs för inflammakomplexbildning uppströms om ICE mognad. Några inflamma stimulerande signaler inkluderar bakteriella membran porbildande toxiner (t.ex. nigericin), lysosomala störa kristaller (t.ex. mono uratkristaller, MSU) och extracellulärt ATP. Uppströms mekanism som leder till NLRP3 inflamma aktivering av dessa olika aktivatorer är oklart. Studier som undersöker signalerings uppströms av inflammabildning föreslår att intracellulära händelser, såsom induktion av hypokalemi eller reaktiva syreradikaler (ROS) indirekt aktivera inflamma 13-28. Bland de olika virus aktivatorer av NLRP3 inflamma är influensa, vilket ger bÖvr primär och sekundär signal som krävs för IL-1β sekre 3, 29-33. Använda mus NLRP3 knockout modeller konstaterades det att IL-1β-utsöndring i DCs är NLRP3 beroende 32. Dessutom NLRP3 knockoutmöss lockade färre leukocyter till platsen för infektion och haft en högre dödlighet 2, 5. Två nya tidningarna tyder på en mekanism för NLRP3 inflamma aktivering under influensa virusinfektion; första, primning genom erkännande av viralt RNA genom TLR7 eller TLR8 (beroende på TLR expression av den svarande cell) eller genom avkänning av bakteriefloran genom annan TLRs att inducera cytoplasmatisk pro-IL-1β uttryck, följd av en andra signal, aktivering av NLRP3 inflammabildning genom viral jonkanalsprotein M2 på den trans-Golgi nätverket 33, 34. I det senare steget, utlösning av NLRP3 inflamma åstadkommes genom störning av det intracellulära jonisk &lt;em&gt; miljö som leder till ROS produktion, vilket är, helt enkelt, kände av NLPR3 som en signal för att bilda inflammasome. Emellertid förblir den exakta mekanismen för inflamma aktivering uppströms om ICE-aktivitet under influensainfektion fortfarande oklart. Detta arbete beskriver en teknik värdefullt för att studera NLRP3 inflamma i mänskliga moDCs som kan användas som en grund för vidare utredning av banan underliggande DC baserat IL-1β sekretion som svar på TLR8 ligation med R848 följt av aktivering av inflamma genom en väl känd aktivator av NLRP3, nigericin. Variationer av denna metod kan användas med andra celltyper, inklusive, men inte begränsat till: monocyter, makrofager, andra DC-undergrupper, och epitelceller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Inflammatoriska processer till följd av utsöndring av interleukin (IL) -1 familje cytokiner av immunceller leder till lokal eller systemisk inflammation, vävnadsombildning och reparationer, och virologisk kontroll 1, 2. Interleukin-1β är en viktig del av det medfödda immunförsvaret och bidrar till att eliminera invaderande patogener samtidigt förhindra etableringen av ihållande infektion 1-5. Inflammasomes är nyckeln signaleringsplattform för aktivering av interleukin-1-omvandlande enzym (ICE eller Caspase-1). NLRP3 inflamma kräver minst två signaler i DCs att orsaka IL-1β sekre 6. Pro-IL-1β-proteinuttryck är begränsat i vilande celler; därför en priming signal krävs för IL-1β-transkription och proteinuttryck. En andra signal som avkänns av NLRP3 resulterar i bildningen av den av flera protein NLRP3 inflamma. Förmågan hos dendritceller att ansvarigtd till de signaler som krävs för IL-1β-utsöndring kan testas med användning av en syntetisk purin, R848, som avkänns av TLR8 i human monocyt-härledda dendritiska celler (moDCs) att prima celler, följt av aktivering av NLRP3 inflamma med bakteriellt toxin och kalium jonofor, nigericin. Härstammar från monocyter DCs lätt produceras i kultur och ger betydligt fler celler än renade human myeloid DC. Den metod som presenteras här skiljer sig från andra inflamma analyser genom att den använder in vitro människa, i stället för mus härledd, DCs vilket möjliggör studier av inflamma i human sjukdom och infektion.

Dessa tekniker mäter TLR8 priming med R848. Intracellulär cytokin färgning för pro-IL-1β tillåter mikroskopi och FACS avläsning från CD14 - CD11c + moDCs. Båda teknikerna kan kvantifieras i förhållande till en icke primade, eller vila, cellkontroll liksom en isotyp kontroll (fig. 1 och 2). Procent av pro-IL-1β + färgningsceller multipliceras med den geometriska symmetri av denna population för att åstadkomma medianfluorescensintensitet (MFI). MFI är jämf...

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃŽÂ² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering och Mätning av NLRP3 inflamma aktivitet med användning av IL-1β i human monocyt-härledda dendritiska celler

Dendritiska celler (DC) utsöndrar IL-1β som svar på TLR8 erkännande av syntetisk purin, R848, följt av NLRP3 inflamma aktivering med nigericin därför IL-1β kan användas för att mäta NLRP3 inflamma aktivitet. Intracellulär cytokin färgning, immunoblotting, och ELISA används för att noggrant mäta NLRP3 inflamma priming och aktivering via IL-1β uttryck.

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Mätning av Faktor V aktivitet i human plasma Med hjälp av en analys Microplate Koagulation

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infektion modell för att studera<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions in Human primära monocyt-härledda Immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från Imaging Flow Cytometry: en jämförelse mellan två monocyt Isoleringsprotokoll

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Utveckling och validering av en Ultrasensitive enda molekyl Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay för humant Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Kvantifiering av Monocytisk Chemotaktisk aktivitet in vivo och karakterisering av Blodmonocyte härledda makrofager

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA elektroporation att modulera autofagi i herpes simplex virus typ 1-infekterade Monocyte-derived dendritiska celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro-stimulering och visualisering av extracellulär fälla release i differentierade humana Monocyte-derived makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Visualisering av inflammatorisk kaspas inducerad närhet i humana monocyt-härledda makrofager

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Bestämning av vaccinimmunogenicitet med hjälp av dendritiska celler härledda från nötkreatur

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...