Name: sequential in vivo imaging of osteogenic stem/progenitor cells during fracture repair
Uploaded: 2014-05-23T13:00:00
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Ringraziamo C. Park per la lettura del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIAMS sotto Award numero K01AR061434 e Leukemia &amp; Lymphoma Society Fellowship Award (5127-09) per DP e le sovvenzioni dei National Institutes of Health a CPL e DTS Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente l&#39;opinione ufficiale del National Institutes of Health.

1. Mouse e precondizionamento Nota: Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni esenti da organismi patogeni e tutti i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC) presso il Massachusetts General Hospital. Tutto l&#39;intervento chirurgico dovrebbe essere eseguito in condizioni sterili, usando materiale sterile autoclave. Mx1-Cre 15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-pomodo...

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	<li>Harada, S., Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+osteoblast+function+and+regulation+of+bone+mass.">Control of osteoblast function and regulation of bone mass.</a> Nature. 423, 349-355 (2003).</li><li>Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+old+means+to+bone.">What old means to bone.</a> Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).</li><li>Khosla, S., Riggs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+age-related+bone+loss+and+osteoporosis.">Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis.</a> Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).</li><li>Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. 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Cloning in vitro and retransplantation in vivo.</a> Transplantation. 17, 331-340 (1974).</li><li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche.">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Bone+Marrow+MSCs+Are+Dynamic,+Fate-Restricted+Participants+in+Bone+Maintenance+and+Regeneration.">Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).</li><li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+promotes+progress+in+orthopedic+research.">Molecular imaging promotes progress in orthopedic research.</a> Bone. 39, 965-977 (2006).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).</li><li>Tu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osterix+overexpression+in+mesenchymal+stem+cells+stimulates+healing+of+critical-sized+defects+in+murine+calvarial+bone.">Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone.</a> Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).</li></ol>

La regolazione delle cellule staminali scheletriche può essere di grande importanza per definire i metodi migliori per raggiungere la rigenerazione ossea. Imaging quantitativo e sequenziale a livello cellulare è stato tecnicamente difficile. Sebbene il modello frattura delle ossa lunghe topo è stato ampiamente utilizzato e adatto per studi biomeccanici 17, la sua posizione tessuti profondi, dimensione frattura irregolare, danni ai tessuti molli, e l&#39;applicazione di fissatori stabilizzanti hanno limitat...

Malattie degenerative delle ossa e perdita di massa ossea correlata all&#39;età portando ad un elevato rischio di fratture osteoporotiche è diventata una sfida importante nella salute pubblica 1. Manutenzione Bone è controllato da osteoblasti che formano l&#39;osso e osteoclasti osso-riassorbimento. Difetti di cellule che formano l&#39;osso sono una causa principale di perdita di massa ossea legata all&#39;età e le malattie degenerative delle ossa 2,3. Mentre la vasta ricerca si è concentrata sul miglioramento della guarigione della frattura, la scoperta di farmaci affidabili per curare le malattie degenerative delle ossa e per invertire la debolezza delle fratture osteoporotiche rimane una questione importante. Così, studiando la fonte di cellule ossee e dei loro meccanismi di controllo nella rigenerazione e riparazione ossea fornisce un quadro nuovo per migliorare la rigenerazione scheletrico e inverse malattie perdita ossea. È stato proposto l&#39;esistenza di cellule mesenchimali multipotenti nel midollo osseo basata sull&#39;identificazione delle popolazioni clonogeniche che potrebbero diversaIATE in osteogenico, lignaggi adipogenico e condrogeniche ex vivo 4. Recentemente, diversi studi hanno dimostrato che le cellule staminali scheletriche / mesenchimali (SSC / MSC) sono una fonte naturale di osteoblasti e sono fondamentali per il turnover osseo, ristrutturazione e riparazione di fratture 5,6 . Inoltre, il nostro studio-lineage tracing rivelato che gli osteoblasti maturi hanno inaspettatamente breve emivita (~ 60 giorni) e sono continuamente alimentati dalla loro cellule staminali / progenitrici in entrambe le normali condizioni omeostatiche e riparazione di frattura 6. Tuttavia, l&#39;identità in vivo di cellule staminali e come tali cellule reagiscono a fratturarsi lesioni e la fornitura di cellule ossee sono chiari. Pertanto, è importante sviluppare un metodo che sia in grado di analizzare la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle endogeni SSC / MSC in circostanze fisiologiche. Riparazione della frattura è un processo multi-cellulare e dinamico regolato da una serie di complessicitochine e fattori di crescita 7. L&#39;approccio più comune per gli studi di frattura è quello di utilizzare un modello animale con frattura delle ossa lunghe e analizzare ossa sezionando osso e tecniche di immunofluorescenza 8-10. Questo processo di riparazione può essere monitorato da più tecniche di imaging, tra cui micro-CT 11, vicino infrarosso fluorescenza 12, e chemiluminescenza immagini 13. Tuttavia, ogni tecnica ha alcune limitazioni e non vi è stato alcun modo efficace per monitorare la funzione SSC / MSC a livello cellulare in vivo. Recentemente, confocale / due fotoni microscopia intravitale è stato sviluppato e utilizzato per rilevare le cellule tumorali trapiantate e cellule staminali ematopoietiche nel contesto del loro microambiente midollare anche a risoluzione unicellulare in animali vivi 14. Combinando questa tecnologia con una serie di modelli di tracciamento lignaggio, siamo stati in grado di definire che le cellule staminali osteogenic / progenitrici possono essere geneticamente caratterizzati da ac transitoriativazione della resistenza myxovirus -1 (Mx1) promotore e progenitori MX1-indotta in grado di mantenere la maggior parte degli osteoblasti maturi nel tempo, ma non partecipare alla generazione dei condrociti nel topo adulto 6. Inoltre, abbiamo dimostrato che OSPCs MX1-etichettati forniscono la maggior parte dei nuovi osteoblasti in guarigione della frattura 6. Qui, utilizzando modelli di monitoraggio osteo-lignaggio e la microscopia intravitale, un protocollo è prevista per definire la cinetica in vivo di + osteogenici cellule staminali / progenitrici MX1 nella riparazione della frattura. Questo protocollo offre immagini sequenziale per monitorare il trasferimento di osteogenici staminali / progenitori in siti di frattura e la misurazione quantitativa di espansione osteoprogenitrici nel processo di riparazione precoce. Questo approccio può essere utile in diversi contesti compresa la valutazione dei candidati terapeutici per migliorare la riparazione ossea.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">C57BL/6J (H-2b)</td>
			<td style="width:140px;">Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)</td>
			<td style="width:195px;">000664</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ketamine Hydrochloride Injection</td>
			<td style="width:140px;">Bionichepharma</td>
			<td style="width:195px;">67457-001-10</td>
			<td>&#160;Vial size: 10 ml (50 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine Sterile Solution</td>
			<td style="width:140px;">Lloyd Inc.</td>
			<td style="width:195px;">NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buprenorphine Hl</td>
			<td style="width:140px;">BEDFORD LAB</td>
			<td style="width:195px;">NDC 55390-100-10</td>
			<td>Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS, 1X</td>
			<td style="width:140px;">CORNING cellgro</td>
			<td style="width:195px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol)</td>
			<td style="width:140px;">Kendall WEBCOL</td>
			<td style="width:195px;">5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine Surgical Scissor</td>
			<td style="width:140px;">F.S.T</td>
			<td style="width:195px;">14568-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extra fine Forceps</td>
			<td style="width:140px;">F.S.T</td>
			<td style="width:195px;">11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VICRYL*Plus Suture</td>
			<td style="width:140px;">Ethicon</td>
			<td style="width:195px;">VCP490G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qtracker 705 non-targeted quantum dot</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:195px;">Q21061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methocel 2%</td>
			<td style="width:140px;">OmmiVision</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">P0913-50MG</td>
			<td>100 &#956;l (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers</td>
			<td style="width:140px;">Spectra Physics</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser</td>
			<td style="width:140px;">Cobolt AB</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Radius-635 HeNe laser</td>
			<td style="width:140px;">Coherent</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential in vivo imaging of osteogenic stem/progenitor cells during fracture repair

Bone gira continuamente ed è altamente rigenerante seguendo lesioni. Cellule staminali / progenitrici osteogenici sono stati a lungo ipotizzato di esistere, ma in vivo dimostrazione di tali cellule è stato solo di recente raggiunto. Qui, sono forniti vivo tecniche di imaging ad investigare il ruolo delle cellule staminali / progenitrici osteogenici endogeni (OSPCs) e la loro progenie in riparazione ossea. Utilizzando cellule osteo-lineage tracing modelli e immagini intravitale di microfratture indotte in osso cranica, OSPCs può essere direttamente osservato durante i primi giorni dopo la lesione, in cui si verificano eventi critici nel processo di riparazione precoce. Siti di lesione può essere ripreso in sequenza rivelando che OSPCs trasferirsi al pregiudizio, aumentare in numero e differenziarsi in osteoblasti che formano l&#39;osso. Questi metodi offrono un mezzo per indagare il ruolo dei regolatori molecolari delle cellule staminali-intrinseci ed estrinseci per la rigenerazione e la riparazione ossea.

<html> La lunga modello di frattura ossea stabilizzato è stato popolare negli studi di frattura. Tuttavia, ossa lunghe o grandi modelli frattura causare danni ai tessuti aerei e quindi hanno una limitazione nella misurazione quantitativa della funzione delle cellule dell&#39;osso. Abbiamo sviluppato un pregiudizio minimamente invasiva (meno di 1 mm di diametro con minima o nessuna invasione nella dura madre) su ossa frontali cranica con perforazione dell&#39;ago (Figure 1A-1C). Abbiamo scelto una vista ...

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Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

La misurazione quantitativa della funzione progenitrici del midollo in guarigione della frattura richiede una tecnologia di imaging seriale ad alta risoluzione. Qui, sono ottenute utilizzando protocolli per microscopia intravitale e inseguimento osteo-lineage sequenzialmente immagine e quantificare la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali endogene osteogenico / progenitrici nel processo di riparazione di fratture ossee.

Sequenziale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo doppio substrato Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

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