Name: excitotoxic stimulation of brain microslices as an in vitro model of stroke
Uploaded: 2014-02-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por fundos de pesquisa do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália, o Instituto de Pesquisa Médica Hunter, e da Universidade de Newcastle.

Todos os procedimentos são realizados com a aprovação da Universidade de Newcastle Animal Care e do Comitê de Ética, bem como de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes, incluindo a Lei de NSW Pesquisa Animal, o regulamento Animal Research NSW, e do Código australiano de Prática para a cuidado e uso de animais para fins científicos. 1. Dissecção do Tecido Cerebral <ol><li> Sacrifício ratos machos 12 semanas de idade por decapitação. Os ratos podem ser sacrificados ...

<ol>
	<li>Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+challenges+and+opportunities+in+stroke.">Mechanisms, challenges and opportunities in stroke.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).</li><li>Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+excitotoxic+neuronal+death.">Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death.</a> Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).</li><li>Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3H]MK-801+binding+in+immature+and+mature+chicken+forebrain.">3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).</li><li>Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+glutamate+receptor+stimulated+inositol+phospholipid+metabolism+and+45Ca(2+)-accumulation+in+posthatch+chicken+forebrain.">Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).</li><li>Sharps, E. S., McCarl, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+performance+liquid+chromatographic+method+to+measure+32P+incorporation+into+phosphorylated+metabolites+in+cultured+cells.">A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells.</a> Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).</li><li>Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurment+of+the+ADP:ATP+ratio+in+human+leukaemic+cell+lines+can+be+used+as+an+indicator+of+cell+viability,+necrosis+and+apoptosis.">Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis.</a> J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).</li><li>Rodnight, R., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+tissue+metabolism:+3.+Study+of+tissue+fragments+with+little+or+no+added+aqueous+phase,+and+in+oils.">Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils.</a> Biochem. J. 57, 649-661 (1954).</li><li>Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly+in+the+absence+of+added+nucleotides.">Microtubule assembly in the absence of added nucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).</li></ol>

Nisto, uma técnica in vitro em para a geração de microslices que podem ser utilizados para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na excitotoxicidade e morte celular mediada por isquemia em tecido cerebral intacto madura é descrito. Esta técnica produz tecido viável (Figuras 1-3), que é metabolicamente semelhante para maiores fatias organotípicas 15. Além disso, este modelo MicroSlice corresponda à resposta observada após excitotoxicity mediada lesões cerebrais <em...

A forma mais comum de AVC é acidente vascular cerebral isquêmico, que ocorre quando um vaso sanguíneo cerebral torna-se obstruída. A isquemia do tecido que resulta da cessação do fluxo sanguíneo provoca a despolarização das membranas generalizada, a libertação de neurotransmissores excitatórios, e a elevação sustentada do cálcio intracelular, que conduz à activação de vias de morte celular 1. Este processo tem sido denominado &quot;excitotoxicidade&quot;, e é uma via comum envolvido na morte neuronal produzido por uma variedade de patologias, incluindo acidente vascular cerebral 2. A inibição das vias de sinalização envolvidas na excitotoxicidade e outras cascatas de morte celular neuronal é uma abordagem atraente para limitar os danos neuronal após o AVC. Identificar os mecanismos moleculares precisos envolvidos na excitotoxicidade e acidente vascular cerebral isquêmico pode ser difícil quando se utiliza sistemas animais inteiros. Como, embrionário primário, e &#39;neuronal-like&#39; (por exemplo, neuroblastoma e adenocarcinoma linhas imortalizados) sistemas de cultura de células são usadas frequentemente. As principais vantagens destes modelos é que eles são fáceis de manipular, relativamente eficaz em termos de custos, e a morte celular pode ser facilmente medido e quantificado. No entanto, as vias de sinalização pode ser alterada por condições de cultura utilizadas de 3,4, e os neurónios imaturos e imortalizado linhas podem expressar diferentes receptores e moléculas de sinalização, quando comparado a amadurecer cérebro 5-8. Além disso, os neurónios cultivados apenas permitir o exame de um tipo de célula (ou dois, se um sistema de co-cultura é utilizado), enquanto que o tecido cerebral intacto é heterogénea, contendo uma variedade de tipos de células que interagem uns com os outros. Sistemas de cultura de explantes (organotípicas de fatias finas de tecido de cérebro), também são utilizados, e estes modelos permite que o estudo de populações heterogéneas de células à medida que são encontrados in vivo. No entanto, apenas uma quantidade limitada de tecido pode ser obtida a partir de cada animal, ao utilizar esta técnica, as fatias podenão ser cultivados durante o tempo que as linhas de células imortalizadas, e meio de cultura de longo prazo pode resultar em alterações nas vias de sinalização e receptores nas fatias. Embora cérebro maduro pode ser usado para gerar fatias organotípicas, fatias de cérebro imaturo são mais propícios para a cultura, e são mais vulgarmente utilizados. Existe, portanto, a necessidade de se desenvolver modelos que imitam ou representam cérebro intacta madura, que são fáceis de usar, em que as vias de sinalização neuronal pode ser examinada. Nisto, uma técnica in vitro, que envolve o tecido nervoso intacto, que pode ser utilizado para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular na sequência de um insulto excitotóxico ou isquémico é descrito. Esta técnica reduz o número de animais necessários para realizar uma experiência, é reprodutível, e gera tecido viável que se comporta de uma forma semelhante à metabolicamente fatias organotípicas maiores. Além disso, o circuito neuronal, as interacções celulares, e co pós-sinápticampartment permanece parcialmente intacta. O tampão fisiológico utilizado permite que os membranas celulares para &#39;lacrar novamente&#39;, e permite que as células para recuperar sua resistência da membrana 9 original. Este modelo de fatia de cérebro é capaz de imitar fielmente as respostas observadas a seguir excitotoxicity mediada lesões cerebrais 10, e pode ser usado para examinar os mecanismos moleculares envolvidos no acidente vascular cerebral.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Guillotine</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Used to decapitate animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain chopper</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to generate 100-400 &#956;m brain sections.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Round bottom plastic tubes</td>
			<td style="width:71px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For keeping tissue at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aerating apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flat bottomed polystyrene tubes</td>
			<td style="width:71px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dounce Homogenizer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitotoxic stimulation of brain microslices as an in vitro model of stroke

Examinando os mecanismos moleculares envolvidos em condições neuropatológicas, tais como acidente vascular cerebral isquêmico, pode ser difícil quando se utiliza sistemas animais inteiros. Como são comumente utilizados &#39;neuronal-como&#39; sistemas de cultura de células, tais, primária ou. Enquanto que estes sistemas são relativamente fáceis de trabalhar, e são úteis em sistemas modelo que vários resultados funcionais (tais como a morte celular) pode ser facilmente quantificados, os resultados analisados ​​e vias em neurónios imaturos em cultura (tais como as vias de morte celular mediada por excitotoxicity) não são necessariamente as mesmas que as observadas no cérebro maduro, ou em tecidos intactos. Portanto, existe a necessidade de desenvolver modelos em que os mecanismos celulares de tecido neural maduro podem ser examinados. Desenvolvemos uma técnica in vitro, que pode ser usado para investigar uma variedade de vias moleculares no tecido nervoso intacto. A técnica aqui descrita utiliza tecido cortical de rato, mas esta técnica pode ser adaptado para o uso de tecidoa partir de uma variedade de espécies (tais como o rato, coelho, cobaia, e galinha) ou regiões do cérebro (por exemplo, hipocampo, estriado, etc.) Além disso, uma variedade de estimulações / tratamentos podem ser utilizados (por exemplo, excitotóxica, a administração de inibidores, etc.) Em conclusão, o modelo de fatia cerebral aqui descrito pode ser usado para examinar uma variedade de mecanismos moleculares envolvidos na lesão cerebral mediada por excitotoxicidade.

Microslices gerados utilizando este procedimento são viáveis, e uma variedade de espécies (por exemplo, rato, ratinho, galinha e) pode ser usado para produzir microslices. Três medidas independentes de viabilidade foram utilizadas: taxa de respiração (Figura 1), as relações de nucleótidos de adenina (figura 2), e o conteúdo de potássio do tecido (Figura 3). Utilizando estas medidas, foi demonstrado que microslices permanecem viáveis ​​durante pelo menos ...

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Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Nós desenvolvemos um modelo de fatia de cérebro que podem ser utilizados para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na lesão cerebral mediada por excitotoxicidade. Esta técnica gera tecido cerebral maduro viável e reduz o número de animais necessários para a experimentação, mantendo o circuito neuronal, interações celulares e compartimentos pós-sinápticos em parte intacta.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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