Name: excitotoxic stimulation of brain microslices as an in vitro model of stroke
Uploaded: 2014-02-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke at JoVE.com

Detta arbete stöddes av forskningsmedel från det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien, Hunter Medical Research Institute och universitetet i Newcastle.

Alla procedurer utförs med godkännande från universitetet i Newcastle Djurvård och etikkommittén, samt i enlighet med de riktlinjer och regler, inklusive NSW Animal Research Act, NSW Animal Research förordningen, och den australiska uppförandekod för skötsel och användning av djur för vetenskapliga ändamål. 1. Dissektion av hjärnvävnad <ol><li> Offer tolv veckor gamla hanråttor genom dekapitering. Råttor kan antingen offras av bedövning och halshuggning, eller kan först ...

<ol>
	<li>Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+challenges+and+opportunities+in+stroke.">Mechanisms, challenges and opportunities in stroke.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).</li><li>Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+excitotoxic+neuronal+death.">Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death.</a> Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).</li><li>Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cAMP/PKA+and+MAPK+signaling+in+neuronal+cells+is+dependent+on+developmental+stage.">Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage.</a> Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).</li><li>Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+effect+of+protein+synthesis+inhibitors+on+potassium+deficiency-induced+apoptotic+cell+death+in+immature+and+mature+neuronal+cultures.">Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures.</a> J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).</li><li>Kristensen, B. W., Noraberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+excitotoxic+profiles+of+ATPA,+AMPA,+KA+and+NMDA+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).</li><li>Lecrux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneously+hypertensive+rats+are+highly+vulnerable+to+AMPA-induced+brain+lesions.">Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions.</a> Stroke. 38, 3007-3015 (2007).</li><li>Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+influx+pathways,+not+calcium+load,+determine+neuronal+vulnerability+to+calcium+neurotoxicity.">Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity.</a> J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).</li><li>Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+central+nervous+system+models+of+mechanically+induced+trauma:+a+review.">In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).</li><li>McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Neurochemistry.">Practical Neurochemistry.</a> , (1975).</li><li>Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha+CaMKII+is+differentially+regulated+in+brain+regions+that+exhibit+differing+sensitivities+to+ischemia+and+excitotoxicity.">alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).</li><li>Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3H]MK-801+binding+in+immature+and+mature+chicken+forebrain.">3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).</li><li>Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+glutamate+receptor+stimulated+inositol+phospholipid+metabolism+and+45Ca(2+)-accumulation+in+posthatch+chicken+forebrain.">Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).</li><li>Sharps, E. S., McCarl, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+performance+liquid+chromatographic+method+to+measure+32P+incorporation+into+phosphorylated+metabolites+in+cultured+cells.">A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells.</a> Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).</li><li>Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurment+of+the+ADP:ATP+ratio+in+human+leukaemic+cell+lines+can+be+used+as+an+indicator+of+cell+viability,+necrosis+and+apoptosis.">Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis.</a> J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).</li><li>Rodnight, R., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+tissue+metabolism:+3.+Study+of+tissue+fragments+with+little+or+no+added+aqueous+phase,+and+in+oils.">Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils.</a> Biochem. J. 57, 649-661 (1954).</li><li>Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly+in+the+absence+of+added+nucleotides.">Microtubule assembly in the absence of added nucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).</li></ol>

Häri är en in vitro-metod för generering av microslices som kan användas för att undersöka de molekylära mekanismer som är involverade i excitotoxicitet och ischemi-förmedlad celldöd i intakta mogna hjärnvävnad beskrivits. Tekniken ger livsduglig vävnad (figurerna 1-3), som är metaboliskt liknar större organotypic skivor 15. Dessutom, detta microslice modell motsvarar nära svaret observerades efter excitotoxicitet medierad hjärnskador in vivo 10. ...

Den vanligaste formen av stroke är ischemisk stroke, vilket sker när en cerebral blodkärl blir tilltäppt. Vävnaden ischemi som resulterar från upphörande av blodflöde orsakar utbredd depolarisation av membran, frisättning av excitatoriska neurotransmittorer och ihållande ökning av intracellulärt kalcium, vilket leder till aktivering av vägar med celldöd 1. Denna process har kallats &quot;excitotoxicitet&quot;, och är en gemensam väg som deltar i neuronal död produceras av en mängd olika sjukdomar, inklusive stroke 2. Hämning av de signalvägar som är involverade i excitotoxicity och andra nervcellsdöd kaskader är en tilltalande strategi för att begränsa neuronal skada efter stroke. Identifiera de exakta molekylära mekanismer som är inblandade i excitotoxicity och ischemisk stroke kan vara svårt när man använder hela djursystem. Som sådan primära embryonala och &quot;neuronal-liknande&quot; (t.ex. neuroblastoma och adenocarcinom odödliga rader) cellodlingssystem används ofta. De främsta fördelarna med dessa modeller är att de är lätta att manipulera, relativt kostnadseffektiv, och celldöd lätt kan mätas och kvantifieras. Däremot kan signalvägar ändras av de odlingsförhållanden som används 3,4, och omogna nervceller och förevigade linjer kan uttrycka olika receptorer och signalmolekyler jämfört med mogna hjärnan 5-8. Vidare endast odlade neuroner tillåta undersökning av en celltyp (eller två, om en coculture system används), medan intakt hjärnvävnad är heterogen, som innehåller en mängd olika celltyper som interagerar med varandra. Organotypiska skiva kultursystem (tunna Explantat av hjärnvävnad) används också, och dessa modeller kan studiet av heterogena populationer av celler eftersom de finns i vivo. Dock kan endast en begränsad mängd vävnad erhållas från varje djur vid användning av denna teknik, skivor kaninte odlas så länge som odödliga cellinjer, och på medellång till lång sikt kultur kan leda till förändringar i signalvägar och receptorer i skivorna. Även mogna hjärnan kan användas för att generera organotypic skivor, skivor från omogna hjärnan är mer mottaglig för kultur, och är mer vanligt utnyttjas. Det finns därför behov av att utveckla modeller som efterliknar eller representerar intakta mogna hjärnan, som är lätta att använda, där neuronala signalvägar kan undersökas. Häri används en i tekniken vitro inbegriper vävnad intakt nervös som kan användas för att belysa molekylära mekanismer som är involverade i celldöd efter en excitotoxisk eller ischemisk insult beskrivas. Denna teknik minskar antalet djur som behövs för att utföra ett experiment, är reproducerbar och genererar livskraftig vävnad som beter sig på ett metaboliskt sätt liknande större organotypic skivor. Dessutom, den neuronala kretsar, cellulära interaktioner, och postsynaptiska compartment fortfarande delvis intakt. Den fysiologiska bufferten som används gör cellmembranen till &quot;återförslutning&quot; och gör att cellerna att återfå sin ursprungliga membranmotståndet 9. Denna hjärna skiva modell kan troget efterlikna reaktioner observerade efter excitotoxicitet medierad hjärnskador 10, och kan användas för att undersöka de molekylära mekanismer som är involverade i stroke.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Guillotine</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Used to decapitate animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain chopper</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to generate 100-400 &#956;m brain sections.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Round bottom plastic tubes</td>
			<td style="width:71px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For keeping tissue at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aerating apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flat bottomed polystyrene tubes</td>
			<td style="width:71px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dounce Homogenizer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitotoxic stimulation of brain microslices as an in vitro model of stroke

Undersöka molekylära mekanismer som är involverade i neuropatologiska tillstånd, såsom ischemisk stroke, kan vara svårt när man använder hela djursystem. Som sådan primär eller &quot;neuronal-liknande&quot; cellkultursystem är vanligen används. Även om dessa system är relativt lätt att arbeta med, och är användbara modellsystem där olika funktionella resultat (såsom celldöd) lätt kan kvantifieras, de undersökta utfall och vägar i odlade omogna nervceller (t.ex. excitotoxicity-medierad celldöd vägar) är inte nödvändigtvis de samma som de som observerats i mogna hjärnan, eller i intakt vävnad. Därför finns det behov av att utveckla modeller där cellulära mekanismer i mogen nervvävnad kan undersökas. Vi har utvecklat en in vitro-teknik som kan användas för att undersöka en rad olika molekylära vägar i vävnad intakt nervös. Den beskrivna tekniken utnyttjar häri råtta kortikal vävnad, men denna teknik kan anpassas för att använda vävnadfrån ett antal olika arter (t.ex. mus, kanin, marsvin och kyckling), eller områden i hjärnan (t.ex. hippocampus, striatum, etc.). Dessutom kan en mängd olika stimuli / behandlingar (t.ex. excitotoxiska, administrering av hämmare, etc.). Sammanfattningsvis kan hjärnan slice modell som beskrivs här användas för att undersöka en rad olika molekylära mekanismer som är involverade i excitotoxicity-medierad hjärnskada.

Microslices som genereras med hjälp av denna procedur är livskraftiga, och en mängd olika arter (t.ex. råtta, mus och kyckling) kan användas för att producera microslices. Tre oberoende mått på lönsamheten har utnyttjats: andningsfrekvens (figur 1), adenin nukleotid förhållanden (figur 2), och vävnadskaliuminnehåll (Figur 3). Med hjälp av dessa åtgärder har det visats att microslices förbli livsduglig under åtminstone 2 h efter generation. <p class...

Watch this Scientific Journal Video about Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke at JoVE.com

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Vi har utvecklat en hjärna skiva modell som kan användas för att undersöka molekylära mekanismer som är involverade i excitotoxicity-medierad hjärnskada. Denna teknik genererar livskraftig mogna hjärnvävnad och minskar antalet djur som krävs för experiment, samtidigt som den neuronala kretsar, cellulära interaktioner, och postsynaptiska fack delvis intakt.

Excitotoxisk Stimulering av Brain Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Modell av stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

Bilateralt gemensamma halspulsådern Ocklusion som en fullgod Konditioneringscykel Stimulus att framkalla tidig ischemisk tolerans till Focal cerebral ischemi

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

En mus modell av subaraknoidalblödning

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch i Brain mikrovaskulära endotelceller (cEND) som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisk hjärnskada Modell av blodhjärnbarriären

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Syre Glukos Deprivation och ny syresättning som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemi-reperfusion skada modell för att studera blodhjärnbarriären dysfunktion

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Multimodal Imaging- and Stimulation-based Method of Evaluating Connectivity-related Brain Excitability in Patients with Epilepsy

En Multimodal Imaging- och stimulering baserad metod för att utvärdera Connectivity relaterade hjämretbarhet i patienter med epilepsi

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations ...

Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain

Autoradiographic Measurements of [14C]-Iodoantipyrine in Rat Brain Following Central Post-Stroke Pain

Autoradiografiska Mätningar av [<sup&gt; 14</sup&gt; C] -Iodoantipyrine i råtthjärna Efter Central Post-Stroke Pain

Approximately 8% of stroke patients present symptoms of central post-stroke pain (CPSP). CPSP is associated with allodynia and hypersensitivity to ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Förbättrad metod för inrättandet av ett In Vitro blod - hjärnbarriären modell baserat på svin hjärnan endotelceller

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Vagus nervstimulering som ett understödjande neurostimulering verktyg för behandlingsresistent Depression

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

Updated Technique for Reliable, Easy, and Tolerated Transcranial Electrical Stimulation Including Transcranial Direct Current Stimulation

Uppdaterad teknik för tillförlitlig, lätt och tolererad Transkrakal elektrisk stimulering inklusive Transkrakala likströms stimulering

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of ...