Name: expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أنوه جامعة أكرون لتمويل التي دعمت هذا العمل.

1. تصميم البروتين المستهدف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية موقع (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) الحصول على تسلسل الأمينية للبروتين الهدف مع الأخذ في الاعتبار نوع من الفائدة والمتغيرات أي لصق. تحديد تسلسل الأحم?...

المؤتلف هندسة البروتينات هي تقنية قوية جدا التي تمتد العديد من التخصصات. أنها فعالة من حيث التكلفة، والانضباطي إجراء بسيط نسبيا، مما يسمح إنتاج غلة عالية من البروتينات مصمم خصيصا. من المهم أن نلاحظ أن تصميم والتعبير عن البروتينات المستهدفة ليست دائما واضحة. التعبير ...

البروتينات تغطي مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية التي هي المسؤولة عن العديد من الوظائف البيولوجية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل الأنسجة السليمة والمنظمة. هذه الجزيئات بدء الآلاف من مسارات الإشارات التي تتحكم يصل التنظيم و / أو أسفل تنظيم الجينات والبروتينات الأخرى، والحفاظ على التوازن داخل الجسم البشري. تعطيل بروتين واحد يؤثر هذا على شبكة الإنترنت بأكملها من الإشارات، التي يمكن أن تؤدي إلى ظهور اضطرابات مدمرة أو الأمراض. هندسة البروتينات الفردية في المختبر يقدم حلا واحدا لمكافحة هذه الآثار الضارة ويوفر بديلا للأدوية جزيء صغير. في عام 1977، وكان الجينات ترميز التسلسل السوماتوستاتين 14 حمض أميني واحد من البروتينية المهندسة الأولى التي تم إنشاؤها باستخدام E. القولونية 1. بعد فترة وجيزة في عام 1979، تم استنساخ الأنسولين في البلازميد pBR322، حولت، أعرب، وتنقيته 2. منذ ذلك الحين، توسعت البروتينات المؤتلف نفوذهم لحقول متعددة من الدقةearch مثل المواد الحيوية، تسليم المخدرات، وهندسة الأنسجة، المستحضرات الصيدلانية البيولوجية، والزراعة، والانزيمات الصناعية والوقود الحيوي وغيرها (للاستعراضات انظر المراجع 3-8). ويرجع إلى حد كبير إلى براعة أن التقنية تقدم عن طريق إضافة الأنصاف تطبيق معين الكيميائية أو تسلسل البروتين لأغراض بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، وتحديد البروتين الهدف وتحقيق الاستقرار وتنقية هذا. عبر تقنية الحمض النووي المؤتلف، والبروتينات المؤتلف يمكن التعبير عنها في مجموعة متنوعة من أنظمة المضيف حقيقية النواة وبدائية النواة بما فيها الثدييات، النباتات، الحشرات، الخميرة، والفطريات، أو البكتيريا. يقدم كل مضيف مزايا مختلفة وعادة ما يتم تحديد أفضل نظام قائم على وظيفة البروتين، والغلة، والاستقرار، والتكلفة الإجمالية، وتطويره. وغالبا ما تفتقر خلايا البكتيريا آليات التعديل بعد متعدية التي توفر المضيفين حقيقية النواة (أي ارتباط بالغليكوزيل، ثاني كبريتيد سد، ه<html> ح.) 5. ونتيجة لذلك، تؤدي أنظمة الثدييات والحشرات عادة في أفضل التوافق والتعبير عن البروتينات حقيقية النواة، ولكن هذه المضيفين وعادة ما تكون أكثر تكلفة وتستغرق وقتا طويلا 9. لذا، E. القولونية هو المضيف يفضل لنظام التعبير لدينا لأن الخلايا التوسع بسرعة في ظروف النمو غير مكلفة وآليات التعبير الجيني مفهومة جيدا 5،9. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام من السهل أن حجم المتابعة لأغراض الإنتاج والنتائج في البروتينات وظيفية على الرغم من عدم وجود تعديلات ما بعد متعدية 10. وE. يتم اختيار سلالة القولونية K12 في هذا البروتوكول لاستنساخ لأن هذه السلالة يقدم عوائد البلازميد ممتازة على أساس الكفاءة التحول عالية. بالإضافة إلى ذلك، E. ويستخدم سلالة القولونية BL21 للتعبير لأن هذه السلالة المضيف يحتوي على الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 الجين الذي يوفر البروتين التعبير للرقابة والاستقرار 11. خيمة &quot;&gt; بعد اختيار المضيف، يجب اتخاذ مزيد من الحذر في اختيار ناقلات التعبير المثالي لتسهيل اختيارها والتحكم التعبير البروتين. توليف البروتينات المؤتلف يبدأ مع تسلسل الحمض النووي المستهدف أن يتم استنساخ بتوجيه من البكتيريا T7 النسخ وإشارات الترجمة، و هو فعل التعبير في الخلايا المضيفة التي تحتوي على نسخ الكروموسومات من الجين T7 الحمض النووي الريبي بوليميراز 12. هذه النواقل، والمستمدة من pBR322 ناقلات البلازميد (للمراجعة أنظر المرجع 13)، وتخضع لرقابة مشددة من قبل المروج T7 وضعت في البداية من قبل الدارس وزملاؤه 14 وتوفير إضافية التحكم من خلال إدراج المشغل أمريكا اللاتينية والكاريبي وأمريكا اللاتينية والكاريبي كاظمة (lac1) 15،16. للالمؤتلف هندسة البروتينات، وهذا النظام التعبير يوفر القدرة على تصميم تسلسل الأحماض الأمينية معينة من البروتين المطلوب عن طريق إدخال مختلفة تسلسل الحمض النووي المستهدف أو لإنشاء البروتينات الانصهار تتكون من المجال جنبا إلى جنبق من البروتينات واحدة. بالإضافة إلى ذلك، بعض النواقل سلسلة تشمل الببتيد علامة تعديلات على وضعها على N C أو محطة. لأغراض التصميم لدينا، تمت إضافة الحامض الاميني (صاحب) علامة لتسلسل الحمض النووي المستهدف لتنقية وأدرج تسلسل biotinylatable 15 الأحماض الأمينية لbiotinylation 17،18. في هذا البروتوكول البلازميد التي تحتوي على الجينات المقاومة الأمبيسلين، تم اختياره لتحمل لنا الانصهار biotinylatable تسلسل البروتين. يتم التحكم في هذا التعبير ناقلات عبر T7 المروج أمريكا اللاتينية والكاريبي والتي يسببها بسهولة مع الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). وتستخدم تعبيرات اختبار (الثقافات على نطاق صغير) لتحديد وجود والذوبان من البروتين المستهدفة، والتي يمكن التعبير عنها في أي شكل قابل للذوبان أو غير قابلة للذوبان في صياغة إجراءات التنقية. وهناك البروتين للذوبان أعرب داخل الخلية البكتيريا الخضوع للطي التلقائي للحفاظ على الهيكل الأصلي لها 19. عادة الأمبنية مواتية الديناميكا الحرارية. في كثير من الحالات النشاط الأيضي للمضيف لا يفضي إلى البروتين الهدف، ووضع الضغط على النظام الذي يؤدي إلى إنتاج بروتين غير قابلة للذوبان وتشكيل الهيئات إدراج تتألف من المجاميع البروتين غير قابلة للذوبان. وبالتالي فإن البروتين الهدف يبدل طبيعة، جعلها غير نشطة بيولوجيا عموما 20. يتم تحجيم المتابعة كلا التعبيرين الاختبار، ويتم تحديد إجراءات العزل عن طريق ذوبان البروتين الهدف. مطلوب استعادة الطبيعة إضافية أو طوي ثانية خطوة للبروتينات قابلة للذوبان. البروتينات المؤتلف الناتجة يمكن تنقيته باستخدام مزيد من حجم الاستبعاد اللوني. في البيت يوفر إنتاج البروتين المؤتلف مزايا التكلفة على المنتجات التجارية منذ ملليغرام من البروتين الهدف يمكن أن تكون معزولة للتر الواحد من الثقافة الرئيسية. معظم المعدات المطلوبة متاحة في مختبر البيولوجية أو الكيميائية التقليدية. الهندسة البروتين يسمح لخلقالبروتينات الانصهار مخصصة مع وظائف المضافة التي ليست دائما متاحة تجاريا. الشكل 1 يصور الإجراءات الرئيسية التي تشارك في البروتينات المؤتلف الهندسة. مع هذا النظام التعبير أنشأنا العديد من البروتينات biotinylatable، مثل انترفيرون غاما، عامل النمو المشتق من الصفيحات، وعظم تخلقية البروتين 21-23، ولكن سوف نركز على اثنين من البروتينات التي قمنا بتصميم لتوجيهات محوار، NGF (29 كيلو دالتون ) وSEMA3A (91 كيلو دالتون) 10 (للمراجعة أنظر المرجع 24). Biotinylation هو أسلوب شائع لتحديد الهوية، وتجميد وعزل البروتينات المسماة باستخدام المعروفة البيوتين streptavidin التفاعل 25-27. تحقيقات الفيزيائية الحيوية 28،29، 30 أجهزة الاستشعار، ونقاط الكم 31 بعض الأمثلة من النظم التي تستخدم تقارب عالية من البيوتين streptavidin اقتران مع د K بناء على أمر من 10 -15 M 27. وE. الحيوي القولونيةيغاز القصدير، البيرة، يساعد في المرفق التساهمية من البيوتين إلى جانب سلسلة يسين وجدت داخل البيوتين الموسومة تسلسل 18،32. وقد أنتجت الربط البيوتين على المواد والجزيئات الحيوية تسليم مستمرة من عوامل النمو إلى الخلية لعدة تطبيقات هندسة الأنسجة 21،33-35. وبالتالي، هندسة هذه البروتينات مصمم خصيصا biotinylatable هو أداة قوية يمكن أن تتجاوز الاهتمامات البحثية متعددة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1,4-dithio--DL-threitol, DTT, 99.5%</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:121px;">127</td>
			<td style="width:239px;">100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">2-Hydroxyethylmercaptan &#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>642</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR001.500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam 204</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6426</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barstar-NGF pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>1 ml; Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bradford reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70922-3</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel filtration standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>151-1901</td>
			<td>6 vials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>152</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">His-Pur Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>EMD&#160;</td>
			<td>HX0603-3</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole&#160;</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>194</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>270</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovaBlue Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69825</td>
			<td>1 ml; Cloning Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>01247</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sema3A-pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate diabasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Terrific Broth</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TER409.5</td>
			<td>5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>667</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone, pancreatic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.07213.1000</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract, granulated</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:299px;">Name of Kits/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">&#160;&#196;KTApurifier10</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">28-4062-64&#160;</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">SHKE4000</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">BirA500</td>
			<td style="width:191px;">Avidity</td>
			<td style="width:121px;">BirA500</td>
			<td style="width:239px;">Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Casette</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">66380</td>
			<td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:191px;">Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:121px;">132127, 132129</td>
			<td style="width:239px;">MWCO: 25,000 and 50,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flow Diversion Valve FV-923</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">11-0011-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:121px;">1094598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Frac-950 Tube Racks, Rack C</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fraction Collector Frac-950</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-00</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heated/Refrigerated Circulator&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">13271-102</td>
			<td>Model 1156D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heating Oven FD Series</td>
			<td style="width:191px;">Binder</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Model FD 115</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">17-1069-01</td>
			<td style="width:239px;">Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">J-26 XPI Avanti Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">393126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JA 25.50 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JLA 8.1 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">969329</td>
			<td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JS 5.3 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:191px;">Themo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1849</td>
			<td style="width:239px;">Forma 1800 Series Clean Bench</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:191px;">TECAN</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>infinite M200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">165-8004</td>
			<td style="width:239px;">4-gel vertical electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">456-9036</td>
			<td style="width:239px;">Any kDa, 15-well comb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ni-NTA Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-2512</td>
			<td>49 ml&#160;volume ECONO-Column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:191px;">OMEGA bio-tek</td>
			<td style="width:121px;">D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">164-5052</td>
			<td>250 V, 3 A, 300 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">3119-0050</td>
			<td>50 ml&#160;tubes for JA 25.50 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spin-X UF Concentrators</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">431488, 431483</td>
			<td>&#160;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Subcloning Service</td>
			<td style="width:191px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Protein Services</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ultrasonic Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:121px;">18910445A</td>
			<td>Model CV18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:191px;">Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Model G560</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

وقد استخدمت المؤتلف هندسة البروتينات القولونية (E. كولاي) نظم التعبير عن ما يقرب من 4 عقود، واليوم E. كولاي لا يزال الكائن المضيف الأكثر استخداما على نطاق واسع. مرونة النظام يسمح لإضافة الأنصاف مثل علامة البيوتين (للتفاعل streptavidin) والبروتينات وظيفية أكبر مثل بروتين الفلورية الخضراء أو الكرز الأحمر البروتين. أيضا، وقد مكن دمج الأحماض الأمينية غير طبيعية مثل chelators أيون الفلز، المجموعات الوظيفية على رد الفعل فقط، تحقيقات الطيفية، والجزيئات نقل التعديلات بعد متعدية التلاعب أفضل من خصائص البروتين وظائف. ونتيجة لهذا الأسلوب يخلق البروتينات الانصهار للتخصيص التي تقدم فائدة كبيرة لمختلف مجالات البحث العلمي. وبشكل أكثر تحديدا، قد أدرجت تسلسل البروتين biotinylatable في العديد من البروتينات المستهدفة بسبب تفاعل عالية تقارب بين البيوتين مع أفيدين وstreptavidin. وقد ساعد هذا في تعزيز بالإضافة إلى ذلك كشف وتنقية البروتينات الموسومة فضلا عن فتح المجال لتطبيقات الثانوية مثل الفرز الخلية. وبالتالي، تظهر جزيئات البيوتين المسمى تأثير متزايد وعلى نطاق واسع في مجالات الطب الحيوي وbioindustrial. لغرض بحثنا قمنا هندسة البروتينات الانصهار المؤتلف البيروكسيديز تحتوي على عامل النمو العصبي (NGF) وsemaphorin3A (SEMA3A) مناطق وظيفية. لقد ذكرت سابقا كيف أن هذه البروتينات الانصهار البيروكسيديز، جنبا إلى جنب مع غيرها من تسلسل البروتين النشط، يمكن المربوطة إلى الحيوية لهندسة الأنسجة وأغراض التجدد. يحدد هذا البروتوكول أساسيات الهندسة biotinylatable البروتينات في نطاق مليغرام، وذلك باستخدام T7 لاك محرض النواقل وE. المضيفين التعبير القولونية، بدءا من التحول لتوسيع نطاق المتابعة وتنقيتها.

<html> الاستنساخ واختبار التعبير عندما يتم تنفيذ الطلاء بشكل صحيح، يجب مستعمرات معزولة واحد تشكيل لزيادة فرص نتف البكتيريا الخلايا تحولت نسيلي (الشكل 2A). ومع ذلك، إذا ومطلي عدد كبير جدا من الخلايا، يتم تحضين لوحات ...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

تطوير البروتينات الانصهار biotinylatable لديها العديد من التطبيقات المحتملة في مختلف مجالات البحث العلمي. المؤتلف الهندسة البروتين هو إجراء على التوالي إلى الأمام التي هي فعالة من حيث التكلفة، وتوفير عوائد عالية من البروتينات مصمم خصيصا.

التعبير، والعزلة، وتنقية القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان البيروكسيديز البروتينات لتجديد الأنسجة العصبية

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

استخدام الخلايا الجذعية البشرية ارتشاح لتجديد العظام

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

تصميم وبناء الاصطناعي خارج الخلية مصفوفة (aECM) والبروتينات من<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; للبشرة هندسة الأنسجة

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

عزل الفئران الدهنية المشتقة من الأنسجة الاوعية الدموية الدقيقة شظايا كما وحدات الأوعية الدموية للهندسة الأنسجة

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

ثلاثي الأبعاد الأنسجة المهندسة الانحياز شبكات Astrocyte الخص الآليات الإنمائية وتيسير التجدد العصبي

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من السمحاق السنخية البشرية وآثار فيتامين د على نشاط الخلايا المستمدة من السمحاق أوستيوجينيك

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

الشخصية التوافق البيولوجي في الحيوية لتجديد العظام

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

عملية صب المستندة إلى الغزل الرطب من الجيلاتين لتجديد الأنسجة

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...