Name: expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende The University of Akron til finansiering, der støttede dette arbejde.

1.. Design af målprotein <ol><li> Brug af National Center for Biotechnology Information hjemmeside (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) opnå en amino sekvens for målproteinet under hensyntagen til arten af ​​interesse og eventuelle splejsningsvarianter. Vælg aminosyresekvensen, der svarer til det aktive område af interesse af proteinet. Bemærk: Sema3A blev aminosyrerne 21-747 valgt. Et fusionsprotein blev designet med NGF, hvor sekvensen af barstar, aminosyre 1-90, blev tilsat til NGF aminosyrerne 1...

Rekombinant protein engineering er en meget kraftfuld teknik, der spænder over mange discipliner. Det er omkostningseffektivt, afstemmelige og en forholdsvis enkel procedure, mulighed for produktion af høje udbytter af specialdesignede proteiner. Det er vigtigt at bemærke, at designe og udtrykke målproteiner er ikke altid ligetil. Basal ekspression og rekombinant protein stabilitet afhænger af specifikke valg af vektor, E. coli celle stammer, peptidmærke tilføjelser og dyrkningsmetoder parametre. Vores s...

Proteiner dækker en bred vifte af biomolekyler, der er ansvarlige for mange biologiske funktioner, i sidste ende fører til en ordentlig væv dannelse og organisation. Disse molekyler indlede tusindvis af signalveje, der kontrollerer opregulering og / eller nedregulering af gener og andre proteiner, opretholde ligevægt i det menneskelige legeme. Forstyrrelse af et enkelt protein påvirker hele denne web af signaler, hvilket kan føre til udbrud af ødelæggende lidelser eller sygdomme. Engineering enkelte proteiner i laboratoriet tilbyder én løsning til at bekæmpe disse bivirkninger, og tilbyder et alternativ til små molekyle narkotika. I 1977 et gen, der koder for 14 aminosyrer somatostatin sekvens var en af de første manipuleret polypeptider oprettet ved hjælp af E. coli 1.. Snart efter i 1979 blev insulin klonet i plasmid pBR322, transformeres, udtrykt og renset 2. Siden da har rekombinante proteiner udvidet deres indflydelse til flere områder af research såsom biomaterialer, drug delivery, tissue engineering, biofarmaceutiske, landbrug, industrielle enzymer, biobrændstoffer, etc. (til anmeldelser se referencer 3-8). Dette skyldes i høj grad den alsidighed at teknikken tilbud via tilsætning af applikationsspecifikke kemiske dele eller proteinsekvenser til formål, herunder, men ikke begrænset til, målprotein identifikation, stabilisering og oprensning. Via rekombinant DNA-teknologi, kan rekombinante proteiner udtrykkes i en række eukaryote og prokaryote værtssystemer, herunder pattedyr, plante-, insekt-, gær, svampe eller bakterier. Hver vært tilbyder forskellige fordele og typisk det bedste system bestemmes på basis af protein funktion, udbytte, stabilitet, samlede omkostninger og skalerbarhed. Bakterier celler mangler ofte de post-translationelle modifikation mekanismer, eukaryote værter give (dvs. glykosylering, disulfidbroer, e<html> tc.) 5.. Som et resultat, pattedyr og insekter sædvanligvis resultere i bedre kompatibilitet og udtryk af eukaryote proteiner, men disse værter er typisk dyrere og tidskrævende 9. Derfor E. coli er den foretrukne vært for vores ekspressionssystem fordi cellerne ekspandere hurtigt i billige vækstbetingelser og de ​​genetiske ekspressionsmekanismer er godt forstået 5,9. Derudover er let at skalere op til produktionsformål og resultater i funktionelle proteiner trods manglen på post-translationelle modifikationer 10 dette system. E. coli K12 stammen er valgt i denne protokol til kloning, fordi denne stamme tilbyder fremragende plasmidudbytter baseret på høje transformationseffektiviteter. Derudover en E. coli BL21-stammen anvendes til ekspression, da denne værtsstamme indeholder T7-RNA-polymerase-genet, der giver kontrolleret proteinekspression og stabilitet 11. telt &quot;&gt; Efter valget vært skal yderligere omhu vælge den ideelle ekspressionsvektor at lette udvalgt og kontrolleret protein udtryk. Synthesizing rekombinante proteiner begynder med en mål-DNA-sekvens, der er klonet under ledelse af transkription bakteriofag T7 og oversættelse signaler, og ekspression induceres i værtsceller indeholder kromosomale kopier af T7 RNA-polymerase gen 12. Disse vektorer, der stammer fra plasmid pBR322 (til gennemgang se reference 13), er stramt styret af T7-promotoren oprindeligt udviklet af Studier og kolleger 14 og give yderligere kontrol gennem inddragelse af lac-operator og lac-repressor (lac1) 15,16. Til rekombinant protein engineering, dette udtryk system giver mulighed for at skræddersy en specifik aminosyresekvens af et ønsket protein ved at indsætte forskellige mål-DNA-sekvenser eller for at skabe fusionsproteiner består af kombineret domænes fra enkelte proteiner. Derudover nogle vektor serien omfatter peptidmærke ændringer, der skal placeres på N eller C-terminalen. For vores design formål blev en histidin (His) tag tilsat til målsekvensen DNA for rensning og en 15 aminosyre biotinylatable sekvens blev inkluderet for biotinylering 17,18. I denne protokol et plasmid indeholdende et ampicillinresistensgen, blev valgt til at bære vores biotinylatable fusion protein sekvenser. Ekspression kontrolleres i denne vektor via T7 lac-promotoren og er let induceret med isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Test udtryk (små kulturer) anvendes til at bestemme tilstedeværelsen og opløselighed af target protein, som kan udtrykkes i enten opløselig eller uopløselig form til at formulere oprensningsprocedurer. Et opløseligt protein udtrykt i bakterie celle vil gennemgå spontan foldning at bevare sin native struktur 19. Typisk den nativestruktur er termodynamisk gunstig. I mange tilfælde er den metaboliske aktivitet af værten er ikke befordrende for målproteinet, lagt vægt på systemet, der fører til uopløseligt protein produktion og dannelsen af ​​inklusionslegemer sammensat af uopløselige proteinaggregater. Således målproteinet denaturerer, hvilket gør dem generelt biologisk inaktivt 20. Begge test udtryk opskaleret og isoleringsprocedurer bestemmes af opløseligheden af ​​målproteinet. En yderligere renaturering eller refoldning trin er nødvendigt for uopløselige proteiner. De resulterende rekombinante proteiner kan oprenses yderligere under anvendelse af gelpermeationskromatografi. I hus rekombinant protein produktion tilbyder omkostningseffektive fordele i forhold til kommercielle produkter, da milligram target protein kan isoleres per liter vigtigste kultur. Størstedelen af ​​det nødvendige udstyr er til rådighed i en typisk biologisk eller kemisk laboratorium. Protein engineering tillader skabelseaf brugerdefinerede fusionsproteiner tilsat funktionaliteter, som ikke altid er kommercielt tilgængelige. Figur 1 viser de vigtigste procedurer, der er involveret i teknik rekombinante proteiner. Med dette udtryk-system har vi skabt mange biotinylatable proteiner, såsom interferon-gamma, blodpladeafledt vækstfaktor, og knogle-morfogenetisk protein 21-23, men vi vil fokusere på to proteiner, som vi designet til Axon vejledning, NGF (29 kDa ) og Sema3A (91 kDa) 10 (for gennemgang se reference 24). Biotinylering er en almindelig teknik til identifikation, immobilisering og isolering af mærkede proteiner anvender den velkendte biotin-streptavidin-interaktion 25-27. Biofysiske sonder 28,29, biosensorer 30, og quantum dots 31 er nogle eksempler på systemer, der udnytter den høje affinitet af biotin-streptavidin konjugation med en Kd på størrelsesordenen 10 -15 M 27. E. coli biotin ligase BirA, hjælpemidler i kovalente binding af biotin til lysin-sidekæde findes inden for biotin mærkede sekvens 18,32. Tethering biotin til materialer og biomolekyler har produceret vedvarende levering af vækstfaktorer til celle for flere vævsdyrkningsapplikationer 21,33-35. Derfor ingeniør disse specialdesignede biotinylatable proteiner er et kraftfuldt værktøj, der kan transcendere flere forskning interesser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1,4-dithio--DL-threitol, DTT, 99.5%</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:121px;">127</td>
			<td style="width:239px;">100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">2-Hydroxyethylmercaptan &#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>642</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR001.500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam 204</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6426</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barstar-NGF pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>1 ml; Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bradford reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70922-3</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel filtration standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>151-1901</td>
			<td>6 vials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>152</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">His-Pur Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>EMD&#160;</td>
			<td>HX0603-3</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole&#160;</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>194</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>270</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovaBlue Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69825</td>
			<td>1 ml; Cloning Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>01247</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sema3A-pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate diabasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Terrific Broth</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TER409.5</td>
			<td>5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>667</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone, pancreatic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.07213.1000</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract, granulated</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:299px;">Name of Kits/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">&#160;&#196;KTApurifier10</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">28-4062-64&#160;</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">SHKE4000</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">BirA500</td>
			<td style="width:191px;">Avidity</td>
			<td style="width:121px;">BirA500</td>
			<td style="width:239px;">Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Casette</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">66380</td>
			<td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:191px;">Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:121px;">132127, 132129</td>
			<td style="width:239px;">MWCO: 25,000 and 50,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flow Diversion Valve FV-923</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">11-0011-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:121px;">1094598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Frac-950 Tube Racks, Rack C</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fraction Collector Frac-950</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-00</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heated/Refrigerated Circulator&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">13271-102</td>
			<td>Model 1156D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heating Oven FD Series</td>
			<td style="width:191px;">Binder</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Model FD 115</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">17-1069-01</td>
			<td style="width:239px;">Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">J-26 XPI Avanti Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">393126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JA 25.50 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JLA 8.1 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">969329</td>
			<td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JS 5.3 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:191px;">Themo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1849</td>
			<td style="width:239px;">Forma 1800 Series Clean Bench</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:191px;">TECAN</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>infinite M200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">165-8004</td>
			<td style="width:239px;">4-gel vertical electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">456-9036</td>
			<td style="width:239px;">Any kDa, 15-well comb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ni-NTA Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-2512</td>
			<td>49 ml&#160;volume ECONO-Column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:191px;">OMEGA bio-tek</td>
			<td style="width:121px;">D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">164-5052</td>
			<td>250 V, 3 A, 300 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">3119-0050</td>
			<td>50 ml&#160;tubes for JA 25.50 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spin-X UF Concentrators</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">431488, 431483</td>
			<td>&#160;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Subcloning Service</td>
			<td style="width:191px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Protein Services</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ultrasonic Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:121px;">18910445A</td>
			<td>Model CV18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:191px;">Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Model G560</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

Rekombinant protein engineering har udnyttet Escherichia coli (E. coli) ekspressionssystemer til næsten 4 årtier, og i dag E. coli er stadig den mest anvendte værtsorganisme. Fleksibiliteten i systemet giver mulighed for tilføjelse af dele såsom en biotin tag (for streptavidin interaktioner) og større funktionelle proteiner som grønt fluorescerende protein eller kirsebærrød protein. Desuden er integrationen af ​​unaturlige aminosyrer, såsom metal-ion-chelatorer, entydigt reaktive funktionelle grupper, spektroskopiske prober og molekyler overfører posttranslationelle modifikationer aktiveret bedre manipulation af proteiners egenskaber og funktionaliteter. Som et resultat af denne teknik skaber tilpasses fusionsproteiner, der tilbyder betydelig nytte for forskellige forskningsområder. Mere specifikt har biotinylatable proteinsekvens blevet indarbejdet i mange målproteiner på grund af den høje affinitet interaktion mellem biotin med avidin og streptavidin. Denne tilføjelse har hjulpet med at forbedre påvisning og rensning af mærkede proteiner samt bane vejen for sekundære applikationer såsom celle sortering. Således biotinmærkede molekyler viser en stigende og udbredt indflydelse i bioindustrielle og biomedicinske områder. Med henblik på vores forskning, vi har udviklet rekombinante biotinyleret fusionsproteiner indeholdende nerve vækstfaktor (NGF) og semaphorin3A (Sema3A) funktionelle regioner. Vi har tidligere rapporteret, hvordan disse biotinylerede fusionsproteiner, sammen med andre aktive proteinsekvenser, kan tøjret til biomaterialer til vævsopbygning og regenerative formål. Denne protokol beskriver de grundlæggende teknik biotinylatable proteiner i milligram skala, udnytte en T7 lac inducerbare vektor og E. coli ekspressionsværter startende fra transformation opskaleringen og rensning.

<html> Kloning og Test Expression Når plettering er udført korrekt, bør enkelte isolerede kolonier danne at øge chancerne for plukning klonal transformerede bakterieceller (figur 2A). Men hvis for mange celler udplades, pladerne inkuberes for længe ved 37 ° C eller transformation er tvivlsom, kolonier kan omfatte agarplade eller danne større aggregater af celler (figur 2B og 2C). Under testudtryk blev NGF og Sema3A fø...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Udvikling biotinylatable fusionsproteiner har mange potentielle anvendelsesmuligheder på forskellige forskningsområder. Rekombinant protein engineering er en ligetil procedure, der er omkostningseffektiv, der giver høje udbytter af specialdesignede proteiner.

Ekspression, isolation og oprensning af opløselige og uopløselige Biotinylerede Proteiner til nervevæv Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Brug af menneskelige perivaskulær stamceller til Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Oprettelse Lim og Opløseligt Gradienter for Imaging Cell Migration med Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D Cellularized kollagengeler for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design og konstruktion af Artificial ekstracellulære matrix (aECM) Proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Til Hud Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolering af murine fedtvæv-afledte mikrovaskulær Fragmenter som Vaskularisering Enheder til Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tre-dimensionelle Tissue Engineering justeret Astrocyte netværk for at sammenfatte udviklingsmæssige mekanismer og lette nervesystem regenerering

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering af mesenkymale stamceller fra menneskelige alveolær Periosteum og effekter af D-Vitamin på Osteogenic aktivitet af Periosteum-afledte celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Biologiske forenelighed profil på biomaterialer for knogle regenerering

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

Wet-spinning-baserede Molding proces af gelatine for vævsregeneration

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...