Name: expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier l&#39;université d&#39;Akron pour le financement en faveur de ce travail.

Une. Conception de la protéine cible <ol><li> Utilisation du Centre national pour le site Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) obtenir une séquence d&#39;acides aminés de la protéine cible en tenant compte des espèces d&#39;intérêt et des variants d&#39;épissage. Sélectionner la séquence d&#39;acides aminés qui correspond à la région active d&#39;intérêt de la protéine. Remarque: Pour Sema3A, acides aminés 21-747 ont été choisis. Une protéine de fusion a été con...

Recombinant ingénierie des protéines est une technique très puissante qui s&#39;étend sur plusieurs disciplines. Il est rentable, accordable et une procédure relativement simple, ce qui permet la production de rendements élevés de protéines sur mesure. Il est important de noter que la conception et l&#39;expression de protéines cibles n&#39;est pas toujours évident. Expression basale et la stabilité de la protéine recombinante dépendent des choix spécifiques de vecteur, E. coli souches cellulaires...

Protéines couvrent une large gamme de biomolécules qui sont responsables de nombreuses fonctions biologiques, conduisant finalement à la formation de tissu propre et de l&#39;organisation. Ces molécules lancer des milliers de voies qui contrôlent la régulation et / ou la régulation de gènes et d&#39;autres protéines de signalisation, maintien de l&#39;équilibre dans le corps humain. Perturbation d&#39;une seule protéine affecte l&#39;ensemble de ce réseau de signaux, ce qui peut conduire à l&#39;apparition de troubles ou de maladies dévastatrices. Ingénierie des protéines individuelles dans le laboratoire propose une solution pour lutter contre ces effets indésirables et offre une alternative aux médicaments à petites molécules. En 1977, un gène codant pour la séquence de la somatostatine 14 d&#39;acides aminés a été l&#39;un des premiers polypeptides modifiés créés à l&#39;aide de E. coli 1. Peu de temps après, en 1979, l&#39;insuline a été cloné dans le plasmide pBR322, transformé, a exprimé, et purifié 2. Depuis lors, des protéines recombinantes ont étendu leur influence à de multiples domaines de resecherche tels que les biomatériaux, l&#39;administration de médicaments, l&#39;ingénierie tissulaire, les produits biopharmaceutiques, de l&#39;agriculture, des enzymes industrielles, les biocarburants, etc (pour avis voir les références 3-8). Ceci est largement dû à la souplesse que la technique propose via l&#39;addition de l&#39;application des fragments chimiques spécifiques ou des séquences de protéines à des fins, y compris, mais sans s&#39;y limiter, l&#39;identification de la protéine cible, de stabilisation et de purification. Via la technologie de l&#39;ADN recombinant, des protéines recombinantes peuvent être exprimées dans une variété de systèmes hôtes eucaryotes et procaryotes, notamment de mammifères, de plantes, d&#39;insectes, de levures, de champignons ou de bactéries. Chaque hôte offre des avantages différents et généralement le meilleur système est déterminée sur la base de la fonction des protéines, le rendement, la stabilité, le coût global, et l&#39;évolutivité. Des cellules de bactéries manquent souvent des mécanismes de modifications post-traductionnelles qui fournissent des hôtes eucaryotes (par exemple glycosylation, le disulfure de pontage, e<html> tc.) 5. En conséquence, les systèmes de mammifères et d&#39;insectes aboutissent généralement à une meilleure compatibilité et l&#39;expression de protéines eucaryotes, mais ces hôtes sont généralement plus coûteux et prend du temps 9. Par conséquent, E. coli est l&#39;hôte privilégié pour notre système d&#39;expression parce que les cellules se développent rapidement dans des conditions de croissance peu coûteux et les mécanismes d&#39;expression génétique sont bien comprises de 5,9. En outre, ce système est facile à l&#39;échelle supérieure à des fins de production et les résultats dans les protéines fonctionnelles en dépit de l&#39;absence de modifications post-traductionnelles 10. Le E. souche de E. coli K12 est choisi dans ce protocole pour le clonage, car cette souche offre d&#39;excellents rendements en plasmide basé sur l&#39;efficacité de transformation élevées. En outre, un E. souche de E. coli BL21 est utilisé pour l&#39;expression, car cette souche hôte contient le gène d&#39;ARN polymerase de T7, qui fournit l&#39;expression des protéines et la stabilité contrôlée 11. tente &quot;&gt; Après la sélection de l&#39;hôte, en outre il faut prendre soin dans le choix du vecteur d&#39;expression idéal pour faciliter l&#39;expression de la protéine choisie et contrôlée. synthèse de protéines recombinantes commence par une séquence d&#39;ADN cible qui est clonée sous la direction du bactériophage transcription de T7 et de signaux de traduction, et l&#39;expression est induite dans des cellules hôtes contenant des copies chromosomiques du gène de l&#39;ARN polymerase T7 12. Ces vecteurs, dérivés de pBR322 du vecteur plasmidique (pour une revue, voir la référence 13), sont étroitement contrôlée par le promoteur T7 initialement développée par Studier et al 14 et de fournir plus d&#39; contrôle grâce à l&#39;inclusion de l&#39;opérateur lac et le répresseur lac (LAC1) 15,16. Pour l&#39;ingénierie des protéines recombinantes, ce système d&#39;expression offre la possibilité d&#39;adapter une séquence d&#39;acides aminés spécifique d&#39;une protéine souhaitée par l&#39;insertion des séquences d&#39;ADN cibles ou pour créer des protéines de fusion composée de domaine combinéss de protéines simples. En outre, certaines séries de vecteurs comprennent des modifications de points de peptides à être mis sur le N ou C-terminale. Pour nos besoins de conception, une histidine (His) tag a été ajouté à la séquence cible d&#39;ADN pour une purification et une séquence biotinylatable 15 d&#39;acides aminés a été inclus pour la biotinylation 17,18. Dans ce protocole, un plasmide contenant un gène de résistance à l&#39;ampicilline, a été choisi pour réaliser nos séquences de protéine de fusion biotinylatable. L&#39;expression est contrôlée dans ce vecteur par l&#39;intermédiaire du promoteur lac de T7 et est facilement induite par isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). expressions de test (cultures à petite échelle) sont utilisés pour déterminer la présence et la solubilité de la protéine cible, qui peut être exprimée soit sous forme soluble ou insoluble à formuler des procédures de purification. Une protéine soluble exprimé dans la cellule de bactérie subira pliage spontané de maintenir sa structure native 19. Typiquement, le natifla structure est thermodynamiquement favorable. Dans de nombreux cas, l&#39;activité métabolique de l&#39;hôte n&#39;est pas propice à la protéine cible, en mettant l&#39;accent sur le système qui conduit à la production de la protéine insoluble et la formation de corps d&#39;inclusion constitués d&#39;agrégats de protéines insolubles. Ainsi, la protéine cible dénature, ce qui les rend généralement biologiquement inactif 20. Les deux expressions de test sont mis à l&#39;échelle en place, les procédures d&#39;isolement et sont déterminées par la solubilité de la protéine cible. Une renaturation ou étape de repliement supplémentaire est nécessaire pour les protéines insolubles. Les protéines recombinantes résultantes peuvent en outre être purifiés en utilisant une Chromatographie d&#39;exclusion de taille. Dans la maison de production de protéines recombinantes offre des avantages de coûts par rapport aux produits commerciaux depuis milligrammes de protéine cible peut être isolé par litre de culture principale. La plupart de l&#39;équipement nécessaire est disponible dans un laboratoire biologique ou chimique typique. L&#39;ingénierie des protéines permet la créationde protéines de fusion personnalisé avec des fonctionnalités supplémentaires qui ne sont pas toujours disponibles dans le commerce. Figure 1 illustre les principales procédures liées à des protéines recombinantes de l&#39;ingénierie. Avec ce système d&#39;expression, nous avons créé de nombreuses protéines biotinylatable, telles que l&#39;interféron-gamma, le facteur de croissance dérivé des plaquettes, et d&#39;os protéine morphogénétique 21-23, mais nous allons nous concentrer sur deux protéines que nous avons conçu pour le guidage axonal, NGF (29 kDa ) et Sema3A (91 kDa) 10 (pour revue voir référence 24). La biotinylation est une technique courante pour l&#39;identification, l&#39;immobilisation et l&#39;isolement des protéines marquées en utilisant la biotine-streptavidine bien connu interaction 25-27. Sondes biophysiques 28,29, biocapteurs 30, et 31 points quantiques sont des exemples de systèmes qui utilisent la haute affinité de la conjugaison de biotine-streptavidine avec un Kd de l&#39;ordre de 10 -15 M 27. Le E. bio coliétain ligase, BirA, aide à la fixation covalente de la biotine à la chaîne latérale de la lysine trouvé à l&#39;intérieur de la séquence étiquetée biotine 18,32. Tethering biotine à des matériaux et des biomolécules a produit une distribution soutenue des facteurs de croissance à la cellule pour de multiples applications de génie tissulaire 21,33-35. Par conséquent, l&#39;ingénierie des protéines biotinylatable conçu sur mesure est un outil puissant qui peut transcender les intérêts de recherche multiples.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1,4-dithio--DL-threitol, DTT, 99.5%</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:121px;">127</td>
			<td style="width:239px;">100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">2-Hydroxyethylmercaptan &#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>642</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR001.500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam 204</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6426</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barstar-NGF pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>1 ml; Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bradford reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70922-3</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel filtration standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>151-1901</td>
			<td>6 vials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>152</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">His-Pur Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>EMD&#160;</td>
			<td>HX0603-3</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole&#160;</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>194</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>270</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovaBlue Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69825</td>
			<td>1 ml; Cloning Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>01247</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sema3A-pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate diabasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Terrific Broth</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TER409.5</td>
			<td>5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>667</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone, pancreatic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.07213.1000</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract, granulated</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:299px;">Name of Kits/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">&#160;&#196;KTApurifier10</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">28-4062-64&#160;</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">SHKE4000</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">BirA500</td>
			<td style="width:191px;">Avidity</td>
			<td style="width:121px;">BirA500</td>
			<td style="width:239px;">Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Casette</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">66380</td>
			<td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:191px;">Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:121px;">132127, 132129</td>
			<td style="width:239px;">MWCO: 25,000 and 50,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flow Diversion Valve FV-923</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">11-0011-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:121px;">1094598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Frac-950 Tube Racks, Rack C</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fraction Collector Frac-950</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-00</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heated/Refrigerated Circulator&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">13271-102</td>
			<td>Model 1156D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heating Oven FD Series</td>
			<td style="width:191px;">Binder</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Model FD 115</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">17-1069-01</td>
			<td style="width:239px;">Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">J-26 XPI Avanti Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">393126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JA 25.50 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JLA 8.1 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">969329</td>
			<td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JS 5.3 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:191px;">Themo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1849</td>
			<td style="width:239px;">Forma 1800 Series Clean Bench</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:191px;">TECAN</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>infinite M200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">165-8004</td>
			<td style="width:239px;">4-gel vertical electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">456-9036</td>
			<td style="width:239px;">Any kDa, 15-well comb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ni-NTA Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-2512</td>
			<td>49 ml&#160;volume ECONO-Column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:191px;">OMEGA bio-tek</td>
			<td style="width:121px;">D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">164-5052</td>
			<td>250 V, 3 A, 300 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">3119-0050</td>
			<td>50 ml&#160;tubes for JA 25.50 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spin-X UF Concentrators</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">431488, 431483</td>
			<td>&#160;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Subcloning Service</td>
			<td style="width:191px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Protein Services</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ultrasonic Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:121px;">18910445A</td>
			<td>Model CV18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:191px;">Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Model G560</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

Recombinant ingénierie des protéines a utilisé Escherichia coli (E. coli) systèmes d&#39;expression pour près de 4 décennies, et aujourd&#39;hui E. coli est toujours l&#39;organisme d&#39;accueil le plus largement utilisé. La flexibilité du système permet l&#39;ajout de groupements tels que une étiquette de biotine (pour les interactions de streptavidine) et des protéines fonctionnelles plus grands comme protéine fluorescente verte ou cerise protéine rouge. De plus, l&#39;intégration des acides aminés non naturels tels que des chélateurs d&#39;ions métalliques, les groupes fonctionnels réactifs de manière unique, des sondes spectroscopiques, et des molécules conférant des modifications post-traductionnelles a permis une meilleure manipulation des propriétés de protéines et de fonctionnalités. En conséquence, cette technique crée des protéines de fusion personnalisables qui offrent une grande utilité pour les différents domaines de recherche. Plus spécifiquement, la séquence de la protéine biotinylatable a été incorporé dans de nombreuses protéines cibles en raison de l&#39;interaction de haute affinité entre la biotine avec l&#39;avidine et la streptavidine. Cet ajout a aidé à améliorer la détection et la purification de protéines marquées ainsi que l&#39;ouverture de la voie à des applications secondaires telles que le tri de cellules. Ainsi, les molécules de biotine montrent une influence croissante et généralisée dans les domaines bio-industrielles et biomédicales. Aux fins de notre recherche, nous avons conçu des protéines de fusion recombinantes biotinylé contenant le facteur de croissance des nerfs (NGF) et semaphorin3A (Sema3A) régions fonctionnelles. Nous avons indiqué précédemment comment ces protéines de fusion biotinylée, avec d&#39;autres séquences de protéines actives, peuvent être attachés à des biomatériaux pour l&#39;ingénierie des tissus et à des fins de régénération. Ce protocole définit les principes de base de protéines de biotinylatable d&#39;ingénierie à l&#39;échelle du milligramme, en utilisant un lac vecteur inductible T7 et E. hôtes d&#39;expression coli, à partir de la transformation à l&#39;échelle et la purification.

<html> Clonage et expression de test Lorsque le placage est effectué correctement, simples colonies isolées devraient former pour augmenter les chances de plumer clonale transformées cellules bactériennes (figure 2A). Cependant, si trop de cellules sont étalées, les plaques sont incubées trop longtemps à 37 ° C ou transformation est discutable, les colonies peuvent couvrir la plaque de gélose ou former de plus grands agrégats de cellules (f...

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Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Expression, Isolation et purification des solubles et insolubles biotinylés protéines pour la régénération des tissus nerveux

Développer des protéines de fusion biotinylatable a de nombreuses applications potentielles dans différents domaines de recherche. Recombinant ingénierie des protéines est une procédure avant droite qui est rentable, offrant des rendements élevés de protéines sur mesure.

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

L&#39;utilisation de cellules souches humaines périvasculaires pour la régénération osseuse

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Recherche

Bio-ingénierie

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Conception et construction de la matrice extracellulaire artificielle (AECM) Protéines de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Pour l&#39;ingénierie tissulaire de la peau

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolement des murins dérivés tissu adipeux microvasculaire fragments comme Vascularization unités pour l&#39;ingénierie tissulaire

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Dimensions des tissus conçus alignement Astrocyte réseaux pour récapituler les mécanismes du développement et de faciliter la régénération du système nerveux

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...