Name: expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00
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लेखक इस काम का समर्थन किया है कि धन के लिए Akron विश्वविद्यालय को स्वीकार करना होगा.

1. लक्ष्य प्रोटीन की डिजाइनिंग <ol><li> जैव प्रौद्योगिकी सूचना वेबसाइट के लिए राष्ट्रीय केन्द्र का उपयोग करना (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) खाते में ब्याज और किसी भी ब्याह वेरिएंट की प्रजातियों लेने लक्ष्य प्रोटीन के लिए ए...

पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग कई विषयों तक फैला है कि एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है. यह कस्टम डिजाइन प्रोटीन की उच्च पैदावार के उत्पादन की अनुमति, लागत प्रभावी, tunable और एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है. यह ?...

प्रोटीन अंततः उचित ऊतक गठन और संगठन के प्रमुख के लिए कई जैविक कार्यों के लिए जिम्मेदार हैं कि biomolecules के एक विस्तृत रेंज को कवर किया. इन अणुओं मानव शरीर के भीतर संतुलन को बनाए रखने, विनियमन अप और / या नीचे विनियमन जीन और अन्य प्रोटीन की है कि नियंत्रण संकेत दे रास्ते के हजारों आरंभ. एक प्रोटीन के विघटन विनाशकारी विकारों या रोगों की शुरुआत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं संकेतों के इस पूरे वेब, को प्रभावित करता है. प्रयोगशाला में व्यक्तिगत प्रोटीन इंजीनियरिंग इन प्रतिकूल प्रभाव का मुकाबला करने के लिए एक समाधान प्रदान करता है और छोटे अणु दवाओं के लिए एक विकल्प प्रदान करता है. 1977 में, 14 एमिनो एसिड सोमेटोस्टैटिन अनुक्रम एक जीन एन्कोडिंग ई. का उपयोग कर बनाया पहला इंजीनियर polypeptides में से एक था कोली 1. इसके तुरंत बाद 1979 में, इंसुलिन, प्लाज्मिड pBR322 में क्लोन तब्दील, व्यक्त, और 2 शुद्ध किया गया था. तब से, पुनः संयोजक प्रोटीन को छोड़कर के कई क्षेत्रों के लिए अपने प्रभाव का विस्तार कियाearch आदि biomaterials, दवा वितरण, ऊतक इंजीनियरिंग, biopharmaceuticals, खेती, औद्योगिक एंजाइमों, जैव ईंधन के रूप में (समीक्षा के लिए संदर्भ 3-8 देखें). इस तकनीक सहित प्रयोजनों के लिए आवेदन विशिष्ट रासायनिक moieties या प्रोटीन दृश्यों के अलावा के माध्यम से प्रदान करता है, लेकिन, लक्ष्य प्रोटीन की पहचान, स्थिरीकरण और शुद्धि के लिए ही सीमित नहीं हैं कि बहुमुखी प्रतिभा के कारण है. पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी के माध्यम से, पुनः संयोजक प्रोटीन स्तनधारी, पौधे, कीट, खमीर, कवक, या बैक्टीरिया सहित यूकेरियोटिक और prokaryotic मेजबान प्रणालियों की एक किस्म में व्यक्त किया जा सकता है. प्रत्येक मेजबान विभिन्न लाभ प्रदान करता है और आम तौर पर सबसे अच्छा प्रणाली प्रोटीन समारोह, उपज, स्थिरता, कुल लागत, और scalability के आधार पर निर्धारित किया जाता है. बैक्टीरिया कोशिकाओं अक्सर यूकेरियोटिक मेजबान (यानी ग्लाइकोसिलेशन, डाइसल्फ़ाइड ब्रिजिंग, ई प्रदान कि बाद translational संशोधन तंत्र की कमी<html> टीसी.) 5. हालांकि इन मेजबान आमतौर पर अधिक महंगा है और समय लेने वाली 9 रहे हैं, नतीजतन, स्तनधारी और कीट प्रणालियों आमतौर पर यूकेरियोटिक प्रोटीन का बेहतर संगतता और अभिव्यक्ति में परिणाम. इसलिए, ई. कोशिकाओं सस्ती विकास की स्थिति में तेजी से विस्तार और आनुवंशिक अभिव्यक्ति तंत्र अच्छी तरह से 5,9 समझ रहे हैं क्योंकि कोलाई हमारी अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए इष्ट मेजबान है. इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली के बाद translational संशोधनों 10 की कमी के बावजूद उत्पादन उद्देश्यों और कार्यात्मक प्रोटीन में परिणाम के लिए ऊपर पैमाने पर करने के लिए आसान है. ई. इस तनाव उच्च परिवर्तन क्षमता पर आधारित उत्कृष्ट प्लाज्मिड पैदावार प्रदान करता है क्योंकि कोलाई K12 तनाव क्लोनिंग के लिए इस प्रोटोकॉल में चुना जाता है. इसके अतिरिक्त, एक ई. इस मेजबान तनाव नियंत्रित प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थिरता 11 प्रदान करता है जो T7 शाही सेना पोलीमरेज़ जीन होता है क्योंकि कोलाई BL21 तनाव अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है. तम्बू &quot;&gt; मेजबान के चयन के बाद, आगे की देखभाल पुनः संयोजक प्रोटीन synthesizing जीवाणुभोजी T7 प्रतिलेखन और अनुवाद संकेतों के निर्देशन में क्लोन है कि एक लक्ष्य डीएनए अनुक्रम के साथ शुरू होता है. चयनित और नियंत्रित प्रोटीन अभिव्यक्ति की सुविधा के लिए आदर्श अभिव्यक्ति वेक्टर के चयन में लिया जाना चाहिए, और अभिव्यक्ति T7 शाही सेना पोलीमरेज़ जीन 12 के गुणसूत्र प्रतियां युक्त मेजबान कोशिकाओं में प्रेरित किया है. प्लाज्मिड वेक्टर pBR322 से निकाली गई इन वैक्टर, (समीक्षा के लिए देख 13 संदर्भ), कसकर शुरू में studier और उनके सहयोगियों ने 14 से विकसित T7 प्रमोटर द्वारा नियंत्रित और अतिरिक्त प्रदान कर रहे हैं लाख ऑपरेटर और लाख repressor (lac1) के शामिल किए जाने के माध्यम से नियंत्रण 15,16. पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए, इस अभिव्यक्ति प्रणाली अलग लक्ष्य डीएनए अनुक्रम डालने से एक वांछित प्रोटीन की एक विशिष्ट एमिनो एसिड अनुक्रम दर्जी के लिए या संलयन प्रोटीन बनाने की क्षमता प्रदान करता है संयुक्त डोमेन से बनाएक प्रोटीन से है. साथ ही, कुछ वेक्टर श्रृंखला एन या सी टर्मिनस पर रखा जाना पेप्टाइड टैग संशोधनों में शामिल हैं. हमारे डिजाइन प्रयोजनों के लिए, एक हिस्टडीन (उनकी) टैग शुद्धि के लिए डीएनए लक्ष्य अनुक्रम को जोड़ा गया है और एक 15 अमीनो एसिड biotinylatable अनुक्रम biotinylation 17,18 के लिए शामिल किया गया था. इस प्रोटोकॉल में एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन युक्त प्लाज्मिड, हमारे biotinylatable संलयन प्रोटीन दृश्यों ले जाने के लिए चुना गया था. अभिव्यक्ति T7 लाख प्रमोटर के माध्यम से इस सदिश में नियंत्रित किया जाता है और आसानी से isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के साथ प्रेरित किया है. टेस्ट अभिव्यक्ति (छोटे पैमाने संस्कृतियों) शोधन प्रक्रियाओं तैयार करने के लिए या तो एक घुलनशील या अघुलनशील रूप में व्यक्त किया जा सकता है जो लक्ष्य प्रोटीन, की उपस्थिति और विलेयता निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है. बैक्टीरिया कोशिका के भीतर व्यक्त एक घुलनशील प्रोटीन अपने मूल संरचना 19 बनाए रखने के लिए सहज तह से गुजरना होगा. आमतौर पर देशीसंरचना thermodynamically अनुकूल है. कई मामलों में मेजबान की चयापचय गतिविधि अघुलनशील प्रोटीन के उत्पादन और अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय से बना शामिल किए जाने निकायों के गठन की ओर जाता है कि प्रणाली पर तनाव रखने, लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुकूल नहीं है. इस प्रकार लक्ष्य प्रोटीन 20 आम तौर पर जैविक रूप से निष्क्रिय उन्हें प्रतिपादन, denatures. दोनों परीक्षण का भाव ऊपर पहुंचा रहे हैं, और अलगाव प्रक्रियाओं लक्ष्य प्रोटीन की घुलनशीलता से निर्धारित होते हैं. एक अतिरिक्त renaturation या कदम refolding अघुलनशील प्रोटीन के लिए आवश्यक है. परिणामस्वरूप पुनः संयोजक प्रोटीन आगे आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है. घर में पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन लक्ष्य प्रोटीन की मिलीग्राम मुख्य संस्कृति के प्रति लीटर अलग किया जा सकता है के बाद से वाणिज्यिक उत्पादों पर लागत लाभ प्रदान करता है. आवश्यक उपकरणों से अधिकांश एक ठेठ जैविक या रासायनिक प्रयोगशाला में उपलब्ध है. प्रोटीन इंजीनियरिंग निर्माण के लिए अनुमति देता हैहमेशा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, जो जोड़ा functionalities के साथ कस्टम संलयन प्रोटीन की. 1 इंजीनियरिंग पुनः संयोजक प्रोटीन में शामिल मुख्य प्रक्रियाओं को दर्शाया गया है चित्रा. इस अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ हम ऐसे इंटरफेरॉन गामा, प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक, और हड्डी morphogenetic प्रोटीन 21-23 के रूप में कई biotinylatable प्रोटीन, बनाया है, लेकिन हम हम अक्षतंतु मार्गदर्शन, NGF (29 केडीए के लिए डिज़ाइन किया गया है कि दो प्रोटीन पर ध्यान दिया जाएगा ) और Sema3A (91 केडीए) 10 (समीक्षा के लिए) 24 संदर्भ देखें. Biotinylation पहचान, स्थिरीकरण और प्रसिद्ध बायोटिन-streptavidin बातचीत 25-27 उपयोग लेबल प्रोटीन के अलगाव के लिए एक सामान्य तकनीक है. Biophysical जांच 28,29, 30 biosensors, और क्वांटम डॉट्स 31 10 -15 एम 27 के आदेश पर एक कश्मीर डी के साथ बायोटिन-streptavidin विकार के उच्च आत्मीयता का उपयोग उन सिस्टम्स के कुछ उदाहरण हैं. ई. कोली बायोटिन ligase, बीरा, बायोटिन के भीतर पाया लाइसिन पक्ष श्रृंखला के लिए बायोटिन के सहसंयोजक लगाव में एड्स के अनुक्रम 18,32 टैग किया. सामग्री और biomolecules के लिए tethering बायोटिन कई ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों 21,33-35 के लिए सेल करने के लिए वृद्धि कारकों की निरंतर वितरण का उत्पादन किया गया. इसलिए, इन कस्टम डिजाइन biotinylatable प्रोटीन इंजीनियरिंग कई अनुसंधान के हितों पार कर सकते हैं कि एक शक्तिशाली उपकरण है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1,4-dithio--DL-threitol, DTT, 99.5%</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:121px;">127</td>
			<td style="width:239px;">100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">2-Hydroxyethylmercaptan &#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>642</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR001.500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam 204</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6426</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barstar-NGF pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>1 ml; Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bradford reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70922-3</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel filtration standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>151-1901</td>
			<td>6 vials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>152</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">His-Pur Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>EMD&#160;</td>
			<td>HX0603-3</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole&#160;</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>194</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>270</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovaBlue Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69825</td>
			<td>1 ml; Cloning Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>01247</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sema3A-pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate diabasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Terrific Broth</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TER409.5</td>
			<td>5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>667</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone, pancreatic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.07213.1000</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract, granulated</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:299px;">Name of Kits/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">&#160;&#196;KTApurifier10</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">28-4062-64&#160;</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">SHKE4000</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">BirA500</td>
			<td style="width:191px;">Avidity</td>
			<td style="width:121px;">BirA500</td>
			<td style="width:239px;">Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Casette</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">66380</td>
			<td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:191px;">Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:121px;">132127, 132129</td>
			<td style="width:239px;">MWCO: 25,000 and 50,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flow Diversion Valve FV-923</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">11-0011-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:121px;">1094598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Frac-950 Tube Racks, Rack C</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fraction Collector Frac-950</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-00</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heated/Refrigerated Circulator&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">13271-102</td>
			<td>Model 1156D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heating Oven FD Series</td>
			<td style="width:191px;">Binder</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Model FD 115</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">17-1069-01</td>
			<td style="width:239px;">Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">J-26 XPI Avanti Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">393126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JA 25.50 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JLA 8.1 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">969329</td>
			<td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JS 5.3 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:191px;">Themo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1849</td>
			<td style="width:239px;">Forma 1800 Series Clean Bench</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:191px;">TECAN</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>infinite M200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">165-8004</td>
			<td style="width:239px;">4-gel vertical electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">456-9036</td>
			<td style="width:239px;">Any kDa, 15-well comb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ni-NTA Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-2512</td>
			<td>49 ml&#160;volume ECONO-Column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:191px;">OMEGA bio-tek</td>
			<td style="width:121px;">D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">164-5052</td>
			<td>250 V, 3 A, 300 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">3119-0050</td>
			<td>50 ml&#160;tubes for JA 25.50 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spin-X UF Concentrators</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">431488, 431483</td>
			<td>&#160;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Subcloning Service</td>
			<td style="width:191px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Protein Services</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ultrasonic Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:121px;">18910445A</td>
			<td>Model CV18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:191px;">Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Model G560</td>
		</tr>
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expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) अभिव्यक्ति लगभग 4 दशकों के लिए सिस्टम, और आज का उपयोग किया गया ई. कोली अभी भी सबसे अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल मेजबान जीव है. प्रणाली का लचीलापन इस तरह के (streptavidin बातचीत के लिए) एक बायोटिन टैग के रूप में moieties और हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन या चेरी लाल प्रोटीन जैसे बड़े कार्यात्मक प्रोटीन के अलावा के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, बाद translational संशोधनों प्रदान धातु आयन chelators, विशिष्ट प्रतिक्रियाशील कार्य समूहों, स्पेक्ट्रोस्कोपी जांच, और अणुओं की तरह अप्राकृतिक अमीनो एसिड के एकीकरण प्रोटीन गुण और functionalities के बेहतर हेरफेर सक्षम है. नतीजतन इस तकनीक अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों के लिए महत्वपूर्ण उपयोगिता है कि प्रस्ताव अनुकूलन संलयन प्रोटीन बनाता है. अधिक विशेष रूप से, biotinylatable प्रोटीन अनुक्रम क्योंकि avidin और streptavidin के साथ बायोटिन के बीच उच्च आत्मीयता बातचीत के कई लक्ष्य प्रोटीन में शामिल किया गया है. इस के अलावा टैग प्रोटीन का पता लगाने और शुद्धि बढ़ाने के साथ ही इस तरह के सेल छँटाई के रूप में माध्यमिक अनुप्रयोगों के लिए रास्ता खोलने में सहायता की है. इस प्रकार, बायोटिन लेबल अणुओं bioindustrial और जैव चिकित्सा के क्षेत्र में एक वृद्धि और व्यापक प्रभाव दिखा. हमारे शोध के प्रयोजन के लिए हम तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) और semaphorin3A (Sema3A) कार्यात्मक क्षेत्रों युक्त पुनः संयोजक biotinylated संलयन प्रोटीन इंजीनियर है. हम इन biotinylated संलयन प्रोटीन, अन्य सक्रिय प्रोटीन दृश्यों के साथ साथ, ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी उद्देश्यों के लिए biomaterials के लिए सीमित किया जा सकता है जैसा कि पहले बताया गया है. इस प्रोटोकॉल एक T7 लाख inducible वेक्टर और ई. के उपयोग, मिलीग्राम पैमाने पर इंजीनियरिंग biotinylatable प्रोटीन की मूल बातें रूपरेखा परिवर्तन करने के लिए पैमाने अप और शोधन से शुरू कोलाई अभिव्यक्ति मेजबान.

<html> क्लोनिंग और टेस्ट अभिव्यक्ति चढ़ाना ठीक से किया जाता है, एक अलग कालोनियों प्रतिरूप तब्दील बैक्टीरिया की कोशिकाओं (चित्रा 2A) तोड़ के अवसरों को बढ़ाने के रूप में करना चाहिए. बहु...

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Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Biotinylatable संलयन प्रोटीन का विकास अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में कई संभावित आवेदन किया है. पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग कस्टम डिजाइन प्रोटीन की उच्च पैदावार प्रदान करने, लागत प्रभावी है कि एक सीधे आगे की प्रक्रिया है.

तंत्रिका ऊतक उत्थान के लिए घुलनशील और अघुलनशील Biotinylated प्रोटीन की अभिव्यक्ति, अलगाव, और शोधन

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

अस्थि पुनर्जनन के लिए मानव Perivascular स्टेम सेल का उपयोग

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग सेल प्रवासन के लिए चिपकने वाला और घुलनशील Gradients बनाना

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

संवहनी ऊतक उत्थान के लिए इंजीनियरिंग 3 डी Cellularized कोलेजन जैल

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

डिजाइन और कृत्रिम बाह्य मैट्रिक्स का निर्माण (aECM) प्रोटीन से<em&gt; Escherichia कोलाई</em&gt; त्वचा के ऊतक इंजीनियरिंग के लिए

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

उच्च throughput एकल सेल अलगाव और संस्कृति के लिए एक microfluidic मंच

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

ऊतक इंजीनियरिंग के लिए vascularization इकाइयों के रूप में म्यूरीन वसा ऊतक व्युत्पन्न माईक्रवैस्कुलर टुकड़े के अलगाव

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

तीन आयामी ऊतक दोहराऊंगा विकासात्मक तंत्र के लिए गठबंधन Astrocyte नेटवर्क इंजीनियर और तंत्रिका तंत्र पुनर्जनन की सुविधा

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

मानव वायुकोशीय Periosteum और विटामिन डी के Osteogenic गतिविधि पर Periosteum-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रभाव से Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं का अलगाव

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

जैव भौतिक हड्डी पुनर्जनन के लिए सामग्री पर संगतता प्रोफ़ाइल

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

ऊतक उत्थान के लिए जिलेटिन की गीली कताई आधारित मोल्डिंग प्रक्रिया

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...