Name: expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke The University of Akron for finansiering som støttet dette arbeidet.

En. Prosjektering av Target Protein <ol><li> Bruk av National Center for Biotechnology Information nettside (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) skaffe amino sekvens for målet protein tar hensyn til arter av renter og eventuelle skjøte varianter. Merk av aminosyresekvensen som svarer til den aktive region av interesse av proteinet. Merk: For Sema3A, ble aminosyrer 21-747 valgt. Et fusjonsprotein ble utformet med NGF, hvor sekvensen av barstar, aminosyre 1 til 90, ble innført i NGF-aminosyrene 122-241.</str...

Rekombinant protein engineering er en meget kraftfull teknikk som spenner over mange fagområder. Det er kostnadseffektivt, fleksibel og en relativt enkel prosedyre, slik at produksjon av høy avkastning av spesialdesignede proteiner. Det er viktig å merke seg at utformingen og uttrykke målproteiner ikke alltid er enkelt. Basal uttrykk og rekombinant protein stabilitet avhenger av spesifikke valg av vektor, E. coli cellestammer, peptid tag tilføyelser og dyrkings parametere. Vår spesifikke designkriterie ut...

Proteiner dekker et bredt spekter av biomolekyler som er ansvarlig for mange biologiske funksjoner, til slutt fører til riktig vev dannelse og organisasjon. Disse molekylene initiere tusenvis av signalveier som styrer opp-regulering og / eller nedregulering av gener og andre proteiner, å opprettholde likevekt i den menneskelige kroppen. Forstyrrelse av et enkelt protein påvirker hele dette nettet av signaler, noe som kan føre til utbruddet av ødeleggende lidelser eller sykdommer. Ingeniør enkelte proteiner i laboratoriet tilbyr en løsning for å bekjempe disse negative effektene, og tilbyr et alternativ til små molekyl narkotika. I 1977, et gen som koder for den 14. aminosyre somatostatin-sekvensen var en av de første modifiserte polypeptider som er opprettet ved hjelp av E. coli ett. Kort tid etter i 1979, ble insulin klonet i plasmid pBR322, forvandlet, uttrykt, og renset to. Siden da har rekombinante proteiner utvidet sin innflytelse til flere felt av resØk ved for eksempel biomaterialer, levering av legemidler, tissue engineering, biofarmasøytiske, jordbruk, industrielle enzymer, biodrivstoff, etc. (for se referanser 3-8). Dette skyldes i stor grad den allsidighet at teknikken tilbyr via tillegg av applikasjonsspesifikke kjemiske rester eller proteinsekvenser for formål, inkludert, men ikke begrenset til, mål protein identifikasjon, stabilisering og rensing. Via rekombinant DNA-teknologi, kan rekombinante proteiner kan uttrykkes i en rekke eukaryote og prokaryote vertssystemer, inkludert pattedyr-, plante-, insekt-, gjær, sopp eller bakterier. Hver vert tilbyr ulike fordeler og vanligvis det beste systemet fastsettes basert på protein funksjon, ytelse, stabilitet, totalkostnadene og skalerbarhet. Bakterieceller ofte mangler de post-translasjonell modifikasjon mekanismer som eukaryote verter gir (dvs. glykosylering, disulfide bridging, e<html> tc.) 5. Som et resultat av pattedyr-og insektsystemer vanligvis resultere i bedre kompatibilitet og ekspresjon av eukaryote proteiner, men disse verter er vanligvis mer kostbare og tidskrevende 9.. Derfor E. coli er den favoriserte vertskap for uttrykket vårt system fordi cellene ekspandere raskt i rimelige vekstforhold og de ​​genetiske uttrykket mekanismene er godt forstått 5,9. I tillegg er enkel å skalere opp til produksjonsformål og resulterer i funksjonelle proteiner til tross for mangelen av post-translasjonelle modifikasjoner 10 av dette system. Den E. coli K12 belastningen er valgt i denne protokollen for kloning fordi denne belastningen tilbyr gode plasmid avkastning basert på høye transformasjons effektivitet. I tillegg kan en E. coli BL21 stamme anvendes for ekspresjon, fordi dette vertsstammen inneholder T7 RNA polymerase-genet som gir kontrollert proteinekspresjon og stabilitet 11.. telt &quot;&gt; Etter at vertsvalg, må ytterligere forsiktighet utvises ved valg av en ideell ekspresjonsvektor for å lette valgt og kontrollert proteinekspresjon. Syntetisere rekombinante proteiner som begynner med en mål-DNA-sekvens som er klonet i regi av bakteriofag T7 transkripsjon og oversettelse signaler, og ekspresjon induseres i vertsceller inneholdende kromosomale kopi av den T7 RNA-polymerase-gen 12.. disse vektorer, avledet fra plasmid pBR322 vektor (for gjennomgang se henvisningstallet 13), blir kontrollert av T7 promoter opprinnelig utviklet av Studier og kolleger 14 og gi ytterligere kontroll gjennom inkludering av lac operator-og lac-repressor (lac1) 15,16. For rekombinant protein engineering, har dette ekspresjonssystem muligheten til å skreddersy en spesifikk aminosyre-sekvensen av et ønsket protein ved å sette inn forskjellige target DNA-sekvenser, eller for å skape fusjonsproteiner består av kombinerte domenets fra single proteiner. I tillegg har noen vektor serien inkluderer peptid tag modifikasjoner som skal plasseres på N eller C endestasjonen. For designformål ble en histidin (His) tag tilsatt til DNA-mål-sekvens for rensning og en 15 aminosyre-sekvens biotinylatable ble inkludert for biotinylering 17,18. I denne protokoll et plasmid som inneholder et ampicillin-resistens-genet, ble valgt til å bære våre biotinylatable fusjonsproteinsekvenser. Ekspresjon styres i denne vektoren via T7 lac-promotoren, og er lett indusert med isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Test uttrykk (småskala kulturer) blir brukt til å bestemme tilstedeværelsen og oppløselighet av målproteinet, som kan uttrykkes i enten en oppløselig eller uoppløselig formen for å formulere renseprosedyrer. En løselig protein uttrykt i bakterier celle vil gjennomgå spontan folding å opprettholde sin opprinnelige struktur 19. Vanligvis de innfødteStrukturen er termodynamisk gunstig. I mange tilfeller er den metabolske aktiviteten til verten ikke bidrar til målproteinet, plassere stress på systemet som fører til uoppløselige proteinproduksjon og dannelse av inklusjonslegemer som består av uoppløselige proteinaggregater. Dermed målproteinet denatures, gjør dem generelt biologisk inaktivt 20. Begge test uttrykk er skalert opp og isoleringsprosedyrer er bestemt av løseligheten av målproteinet. En ytterligere renaturering eller refolding trinnet er nødvendig for uoppløselige proteiner. De resulterende rekombinante proteiner kan bli ytterligere renset ved hjelp av gelfiltrerings-kromatografi. I huset har rekombinant proteinproduksjon kostnads ​​fordeler i forhold til kommersielle produkter siden milligram av målprotein kan isoleres per liter av hovedkulturen. Det meste av det nødvendige utstyr er tilgjengelig i en typisk biologisk eller kjemisk laboratorium. Protein engineering gir mulighet for etableringav tilpassede fusjonsproteiner med ekstra funksjonalitet som ikke alltid kommersielt tilgjengelig. Figur 1 viser de viktigste fremgangsmåter som er involvert i ingeniør rekombinante proteiner. Med dette uttrykket system har vi skapt mange biotinylatable proteiner, slik som interferon-gamma, platelet-derived growth factor, og bein-morphogenetic protein 21-23, men vi vil fokusere på to proteiner som vi utviklet for axon veiledning, NGF (29 kDa ) og Sema3A (91 kDa) 10 (for gjennomgang se referanse 24). Biotinylering er en vanlig teknikk for identifikasjon, immobilisering og isolering av merkede proteiner som benytter den kjente biotin-streptavidin interaksjon 25-27. Biofysiske sonder 28,29, biosensorer 30, og kvanteprikker 31 er noen eksempler på systemer som benytter høye affinitet biotin-streptavidin konjugering med en K d på størrelsesorden 10 -15 M 27. Den E. coli biotinn-ligase, BIRA, hjelpemidler i den kovalente binding av biotin til lysin-sidekjeden finnes innenfor biotin merket sekvens 18,32. Tethering biotin til materialer og biomolekyler har produsert vedvarende tilførsel av vekstfaktorer til celle for flere tissue engineering applikasjoner 21,33-35. Derfor, prosjektering disse spesialdesignede biotinylatable proteiner er et kraftig verktøy som kan overskride flere forskningsinteresser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1,4-dithio--DL-threitol, DTT, 99.5%</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:121px;">127</td>
			<td style="width:239px;">100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">2-Hydroxyethylmercaptan &#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>642</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR001.500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam 204</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6426</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barstar-NGF pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>1 ml; Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bradford reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70922-3</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel filtration standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>151-1901</td>
			<td>6 vials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>152</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">His-Pur Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>EMD&#160;</td>
			<td>HX0603-3</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole&#160;</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>194</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>270</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovaBlue Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69825</td>
			<td>1 ml; Cloning Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>01247</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sema3A-pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate diabasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Terrific Broth</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TER409.5</td>
			<td>5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>667</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone, pancreatic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.07213.1000</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract, granulated</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:299px;">Name of Kits/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">&#160;&#196;KTApurifier10</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">28-4062-64&#160;</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">SHKE4000</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">BirA500</td>
			<td style="width:191px;">Avidity</td>
			<td style="width:121px;">BirA500</td>
			<td style="width:239px;">Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Casette</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">66380</td>
			<td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:191px;">Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:121px;">132127, 132129</td>
			<td style="width:239px;">MWCO: 25,000 and 50,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flow Diversion Valve FV-923</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">11-0011-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:121px;">1094598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Frac-950 Tube Racks, Rack C</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fraction Collector Frac-950</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-00</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heated/Refrigerated Circulator&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">13271-102</td>
			<td>Model 1156D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heating Oven FD Series</td>
			<td style="width:191px;">Binder</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Model FD 115</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">17-1069-01</td>
			<td style="width:239px;">Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">J-26 XPI Avanti Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">393126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JA 25.50 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JLA 8.1 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">969329</td>
			<td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JS 5.3 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:191px;">Themo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1849</td>
			<td style="width:239px;">Forma 1800 Series Clean Bench</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:191px;">TECAN</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>infinite M200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">165-8004</td>
			<td style="width:239px;">4-gel vertical electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">456-9036</td>
			<td style="width:239px;">Any kDa, 15-well comb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ni-NTA Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-2512</td>
			<td>49 ml&#160;volume ECONO-Column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:191px;">OMEGA bio-tek</td>
			<td style="width:121px;">D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">164-5052</td>
			<td>250 V, 3 A, 300 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">3119-0050</td>
			<td>50 ml&#160;tubes for JA 25.50 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spin-X UF Concentrators</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">431488, 431483</td>
			<td>&#160;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Subcloning Service</td>
			<td style="width:191px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Protein Services</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ultrasonic Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:121px;">18910445A</td>
			<td>Model CV18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:191px;">Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Model G560</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

Rekombinant protein engineering har benyttet Escherichia coli (E. coli) ekspresjonssystemer for nesten fire tiår, og i dag E. coli er fortsatt den mest brukte vertsorganisme. Fleksibiliteten i systemet tillater tillegg av deler, så som en biotin signal (for streptavidin interaksjoner) og større funksjonelle proteiner som grønt fluorescerende protein, eller kirsebær rød protein. Videre foreligger det en integrering av unaturlige aminosyrer som metallion-chelatorer, unikt reaktive funksjonelle grupper, spektroskopiske prober, og molekyler som bibringer posttranslasjonelle modifikasjoner aktivert bedre manipulering av protein-egenskaper og funksjonalitet. Som et resultat av denne teknikken skaper passelig fusjonsproteiner som tilbyr betydelig nytteverdi for ulike forskningsfelt. Mer spesifikt har den biotinylatable proteinsekvensen blitt innarbeidet i mange mål proteiner på grunn av den høye affinitet mellom biotin interaksjon med avidin og streptavidin. Dette tillegg har hjulpet i å forbedre deteksjon og rensing av merket proteiner så vel som å åpne veien for sekundære applikasjoner som cellesortering. Dermed biotinmerket molekyler viser en økende og utstrakt innflytelse i bioindustrial og biomedisinske områder. For hensikten med vår forskning har vi konstruert rekombinante biotinylated fusjonsproteiner som inneholder nervevekstfaktor (NGF) og semaphorin3A (Sema3A) funksjonelle regioner. Vi har tidligere rapportert hvordan disse biotinylert fusjonsproteiner, sammen med andre aktive proteinsekvenser, kan være bundet til biomaterialer for vevsteknologi og regenererende formål. Denne protokollen beskriver det grunnleggende ingeniør biotinylatable proteiner på milligram skala, utnytte en T7 lac induserbar vektor og E. coli ekspresjonsverter, med start fra transformasjon for å skalere opp og rensing.

<html> Kloning og Test Expression Når plating er utført på riktig måte, bør enkle isolerte kolonier danne å øke sjansene for å plukker klonal transformerte bakterier celler (figur 2a). Imidlertid, hvis det er for mange celler er belagt, blir platene inkubert for lenge ved 37 ° C eller transformasjon er tvilsom, kolonier kan dekke agar plate eller danne større aggregater av celler (figurene 2B og 2C). Under test eksp...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Expression, Isolation, og Rensing av løselig og uløselig Biotinylated Proteiner for nervevev Regeneration

Utvikling biotinylatable fusjon proteiner har mange potensielle bruksområder i ulike forskningsfelt. Rekombinant protein engineering er en rett frem prosedyre som er kostnadseffektive, noe som gir høy avkastning av spesialdesignede proteiner.

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Bruk av menneskelige perivaskulær stamceller for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Opprette Lim og Løselig overgangar for Imaging Cell Migration med fluorescens mikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Isolering av Cellular lipid dråper: To rensing teknikker Starter fra gjærceller og menneske Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingeniør 3D Cellularized Kollagen Geleer til Vaskulær Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design og bygging av kunstige Ekstracellulær Matrix (aECM) Proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt; For Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikrofluid plattform for High-throughput encellede Isolering og kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolering av Murine fettvev-avledet mikrovaskulær Fragmenter som vaskularisering Enheter for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tredimensjonale vev utvikling justert astrocytter nettverk å Recapitulate utviklingsmessige mekanismer og tilrettelegge nervesystemet gjenfødelse

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering av Mesenchymal stamceller fra menneskelige Alveolar Periosteum og effekter av Vitamin D på Osteogenic aktivitet i Periosteum-avledet celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...