Name: expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Författarna vill tacka för The University of Akron för finansieringen som stött detta arbete.

1. Projektering av målprotein <ol><li> Med hjälp av National Center for Biotechnology Information webbplats (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhålla en amino sekvens för målproteinet med hänsyn till arten av intresse och eventuella splitsvarianter. Välj den aminosyrasekvens som motsvarar den aktiva regionen av intresse för proteinet. Obs! Sema3A ades aminosyrorna 21-747 valt. Ett fusionsprotein designades med NGF där sekvensen av barstar, aminosyra 1 till 90, tillsattes till NGF-aminosyrorna 122-...

Rekombinant protein engineering är en mycket kraftfull teknik som spänner över många discipliner. Det är kostnadseffektivt, avstämbara och en relativt enkel procedur, vilket gör att produktionen av höga utbyten av skräddarsydda proteiner. Det är viktigt att notera att konstruera och uttrycka målproteiner är inte alltid enkelt. Basal uttryck och rekombinanta proteinstabilitet är beroende av specifika val av vektor, E. coli-cellstammar, peptidmärkning additioner och odlingsparametrar. Vår specifika...

Proteiner täcker ett brett spektrum av biomolekyler som är ansvariga för många biologiska funktioner, vilket slutligen leder till korrekt vävnadsbildning och organisation. Dessa molekyler initiera tusentals signalvägar som kontrollerar uppreglering och / eller nedreglering av gener och andra proteiner, bibehålla jämvikt inom den mänskliga kroppen. Rubbning av ett enda protein påverkar hela denna bana av signaler, vilket kan leda till uppkomsten av förödande störningar eller sjukdomar. Engineering enskilda proteiner i labbet erbjuder en lösning för att motverka dessa negativa effekter och erbjuder ett alternativ till småmolekylära läkemedel. År 1977, en gen som kodar för 14 aminosyror somatostatin sekvensen var en av de första modifierade polypeptider som skapats med hjälp av E. coli 1. Strax efter 1979, var insulin klonad i plasmiden pBR322, förvandlas, uttryckt och renat 2. Sedan dess har rekombinanta proteiner utökat sitt inflytande till flera områden av resök såsom biomaterial, drug delivery, vävnadsteknik, biologiska läkemedel, jordbruk, industriella enzymer, biobränslen etc. (för översikter se referenserna 3-8). Detta är till stor del på grund av den mångsidighet som tekniken erbjuder via tillsättning av applikationsspecifika kemiska delar eller proteinsekvenser för syften, inklusive, men inte begränsat till, målprotein identifiering, stabilisering och rening. Via rekombinant DNA-teknologi kan rekombinanta proteiner som uttrycks i en mångfald eukaryota och prokaryota värdsystem inkluderande däggdjurs-, växt-, insekts-, jäst, svamp eller bakterier. Varje värd har olika fördelar och oftast det bästa systemet bestäms utifrån proteinfunktion, avkastning, stabilitet, totalkostnad, och skalbarhet. Bakterier celler saknar ofta de post-translationell modifiering mekanismer som eukaryota värdar ger (dvs. glykosylering, disulfid brygg, e<html> tc.) 5. Som ett resultat, däggdjurs-och insekts system brukar leda till bättre kompatibilitet och uttryck av eukaryota proteiner, men dessa värdar är oftast dyrare och mer tidskrävande 9. Därför E. coli är gynnad värd för vår expressionssystem eftersom cellerna expandera snabbt i billiga tillväxtförhållanden och de genetiska uttryck mekanismerna är väl förstådda 5,9. Dessutom är det lätt att skala upp för produktion och som resulterar i funktionella proteiner trots frånvaro av posttranslationella modifieringar 10 detta system. Den E. coli K12 stam väljs i detta protokoll för kloning eftersom denna stam erbjuder utmärkta plasmid avkastning baserade på hög omvandlingseffektivitet. Dessutom en E. coli BL21-stammen användes för expression eftersom denna värdstammen innehåller T7-RNA-polymerasgenen som ger kontrollerad proteinexpression och stabilitet 11. tält &quot;&gt; Efter värd val, skall ytterligare försiktighet iakttas i valet den perfekta expressionsvektor för att underlätta utvalda och kontrollerade proteinuttryck. Syntetisera rekombinanta proteiner börjar med en mål-DNA-sekvens som är klonade under ledning av bakteriofag T7 transkription och signaler översättning, och expression induceras i värdceller som innehåller kromosomala kopior av T7-RNA-polymerasgenen 12. Dessa vektorer, härledda från plasmid pBR322 (för översikt se referens 13), är tätt kontrolleras av den T7-promotor som ursprungligen utvecklats av Studier och kollegor 14 och ge ytterligare kontroll genom införande av det lac-operatorn och lac-repressorn (lac1) 15,16. För rekombinant proteinteknik, erbjuder denna expressionssystem förmågan att skräddarsy en särskild aminosyrasekvensen för ett önskat protein genom att sätta in olika mål-DNA-sekvenser eller för att skapa fusionsproteiner består av kombinerad domäns från enstaka proteiner. Dessutom kan vissa vektor serien är peptid tag ändringar som skall placeras på N-eller C-terminalen. För våra designändamål var taggen en histidin (His) sattes till DNA-målsekvensen för rening och en 15 aminosyra biotinylatable sekvensen inkluderades för biotinylering 17,18. I detta protokoll en plasmid innehållande en ampicillinresistensgen, valdes för att genomföra våra biotinylatable fusionsproteinsekvenser. Uttryck styrs i denna vektor via T7-lac-promotorn och är lätt induceras med isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG). Test uttryck (småskaliga kulturer) används för att bestämma närvaron och lösligheten av målproteinet, vilket kan uttryckas i antingen en löslig eller olöslig form formulera reningsförfaranden. Ett lösligt protein som uttrycks i bakteriecellen genomgår spontan vikning för att behålla sin ursprungliga struktur 19. Typiskt den nativastruktur är termodynamiskt gynnsam. I många fall kan den metaboliska aktiviteten hos värden är inte bidrar till målproteinet, placera stress på det system som leder till olösliga proteinproduktion och bildning av inklusionskroppar som består av olösliga proteinaggregat. Således målproteinet denaturerar, gör dem generellt biologiskt inaktiva 20. Båda testuttryck skalas upp och isoleringsförfaranden bestäms av lösligheten av målproteinet. Ytterligare en renaturering eller återveck steg krävs för olösliga proteiner. De resulterande rekombinanta proteinerna kan renas ytterligare med användning av storleksuteslutningskromatografi. I huset rekombinant proteinproduktion ger kostnadsfördelar över kommersiella produkter eftersom milligram målprotein kan isoleras per liter huvudkulturen. Det mesta av den nödvändiga utrustningen är tillgänglig i ett typiskt biologiskt eller kemiskt laboratorium. Protein engineering möjliggör skapandeav anpassade fusionsproteiner med kompletterande funktioner som inte alltid är tillgängliga i handeln. Figur 1 visar de viktigaste förfarandena som är involverade i konstruktion av rekombinanta proteiner. Med detta expressionssystem har vi skapat många biotinylatable proteiner, såsom interferon-gamma, platelet-derived growth factor, och ben-morphogenetic protein 21-23, men vi kommer att fokusera på två proteiner som vi utformade för Axon vägledning, NGF (29 kDa ) och Sema3A (91 kDa) 10 (för översikt se referens 24). Biotinylering är en vanlig teknik för identifiering, immobilisering och isolering av märkta proteiner som utnyttjar den välkända biotin-streptavidin samspel 25-27. Biofysiska sonder 28,29, Biosensors 30, och kvantprickar 31 är några exempel på system som utnyttjar den höga affiniteten av biotin-streptavidin konjugering med ett Kd i storleksordningen 10 -15 M 27. Den E. coli biotenn-ligas, BirA, stöd i den kovalenta bindningen av biotin till lysinsidokedja finns inom biotinmärkta sekvens 18,32. Internetdelning biotin material och biomolekyler har producerat ihållande leverans av tillväxtfaktorer till cell för flera vävnadstekniska tillämpningar 21,33-35. Därför engineering dessa skräddarsydda biotinylatable proteiner är ett kraftfullt verktyg som kan överskrida flera forskningsintressen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1,4-dithio--DL-threitol, DTT, 99.5%</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:121px;">127</td>
			<td style="width:239px;">100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">2-Hydroxyethylmercaptan &#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>642</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR001.500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam 204</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6426</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barstar-NGF pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>1 ml; Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bradford reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70922-3</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel filtration standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>151-1901</td>
			<td>6 vials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>152</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">His-Pur Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>EMD&#160;</td>
			<td>HX0603-3</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole&#160;</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>194</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>270</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovaBlue Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69825</td>
			<td>1 ml; Cloning Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>01247</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sema3A-pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate diabasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Terrific Broth</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TER409.5</td>
			<td>5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>667</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone, pancreatic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.07213.1000</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract, granulated</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:299px;">Name of Kits/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">&#160;&#196;KTApurifier10</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">28-4062-64&#160;</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">SHKE4000</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">BirA500</td>
			<td style="width:191px;">Avidity</td>
			<td style="width:121px;">BirA500</td>
			<td style="width:239px;">Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Casette</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">66380</td>
			<td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:191px;">Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:121px;">132127, 132129</td>
			<td style="width:239px;">MWCO: 25,000 and 50,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flow Diversion Valve FV-923</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">11-0011-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:121px;">1094598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Frac-950 Tube Racks, Rack C</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fraction Collector Frac-950</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-00</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heated/Refrigerated Circulator&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">13271-102</td>
			<td>Model 1156D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heating Oven FD Series</td>
			<td style="width:191px;">Binder</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Model FD 115</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">17-1069-01</td>
			<td style="width:239px;">Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">J-26 XPI Avanti Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">393126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JA 25.50 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JLA 8.1 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">969329</td>
			<td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JS 5.3 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:191px;">Themo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1849</td>
			<td style="width:239px;">Forma 1800 Series Clean Bench</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:191px;">TECAN</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>infinite M200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">165-8004</td>
			<td style="width:239px;">4-gel vertical electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">456-9036</td>
			<td style="width:239px;">Any kDa, 15-well comb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ni-NTA Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-2512</td>
			<td>49 ml&#160;volume ECONO-Column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:191px;">OMEGA bio-tek</td>
			<td style="width:121px;">D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">164-5052</td>
			<td>250 V, 3 A, 300 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">3119-0050</td>
			<td>50 ml&#160;tubes for JA 25.50 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spin-X UF Concentrators</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">431488, 431483</td>
			<td>&#160;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Subcloning Service</td>
			<td style="width:191px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Protein Services</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ultrasonic Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:121px;">18910445A</td>
			<td>Model CV18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:191px;">Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Model G560</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

Rekombinant protein engineering har utnyttjat Escherichia coli (E. coli) expressionssystem för nästan 4 decennier och idag E. coli är fortfarande den mest använda värdorganismen. Flexibiliteten hos systemet tillåter tillägg av delar, såsom en biotin-tag (för streptavidin växelverkan) och större funktionella proteiner såsom grönfluorescerande protein eller körsbärsröd protein. Dessutom har integrationen av onaturliga aminosyror såsom metalljon-kelater, unikt reaktiva funktionella grupper, spektroskopiska prober, och molekyler överförande posttranslationella modifieringar aktiverat bättre manipulering av proteinegenskaper och funktioner. Som ett resultat av denna teknik skapar anpassningsfusionsproteiner som erbjuder betydande verktyg för olika forskningsområden. Mer specifikt har det biotinylatable proteinsekvensen införlivats i många målproteiner grund av den höga affinitetsväxelverkan mellan biotin med avidin och streptavidin. Detta tillägg har hjälpt till att förbättra upptäckt och rening av märkta proteiner samt öppnar för sekundära applikationer såsom cellsortering. Således biotinmärkta molekylerna visar en ökande och utbredd inflytande i bioindustrial och biomedicinska områden. För vår forskning har vi konstruerat rekombinanta biotinylerad fusionsproteiner som innehåller nervtillväxtfaktorn (NGF) och semaphorin3A (Sema3A) funktionella regioner. Vi har tidigare rapporterat om hur dessa biotinylerade fusionsproteiner, tillsammans med andra aktiva proteinsekvenser, kan vara bundna till biomaterial för vävnadsteknik och regenerativ ändamål. Detta protokoll beskriver grunderna i teknisk biotinylatable proteiner i milligram skala, att använda en T7-lac inducerbar vektor och E. coli-uttrycksvärdar, med start från transformations att skala upp och rening.

<html> Kloning och testuttryck När plätering utförs på rätt sätt, bör enskilda isolerade kolonier bildas för att öka chanserna att plocka klonal omvandlade bakterieceller (Figur 2A). Om alltför många celler stryks, plattorna inkuberas för länge vid 37 ° C eller transformation är tveksamt, kolonier kan täcka agarplatta eller bilda större aggregat av celler (fig. 2B och 2C). Under testuttryck, NGF och Sema3A f?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Utveckla biotinylatable fusionsproteiner har många potentiella tillämpningar inom olika forskningsområden. Rekombinant protein engineering är en rättfram procedur, som är kostnadseffektiv och ger höga utbyten av skräddarsydda proteiner.

Expression, isolering och rening av lösliga och olösliga Biotinylerade Proteiner för Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Användning av mänskliga perivaskulär stamceller för benuppbyggnad

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Skapa Lim och lösliga övertoningar för Imaging cellmigration med fluorescensmikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingenjörs 3D Cellularized kollagengeler för kärlvävnad Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design och konstruktion av artificiell Extracellular Matrix (AECM) Proteiner från<em&gt; Escherichia coli</em&gt; För hudvävnad Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikroflödessystem plattform för hög genomströmning Single-cell isolering och kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Isolering av murina adipos vävnad Microvascular Fragment som Vaskularisering Aggregat för Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tredimensionella vävnadstekniska justerad Astrocyten nätverk att Recapitulate utvecklingsmässiga mekanismer och underlätta nervsystemet regenerering

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering av mesenkymala stamceller från mänskliga alveolära periostet och effekter av D-Vitamin på osteogent aktivitet av periostet-derived celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Biologisk kompatibilitet profil på biomaterial för ben

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

Våt-spinning-baserade gjutprocessen av Gelatin för vävnadsregeneration

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...