Name: bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets
Uploaded: 2014-03-27T21:00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أنوه بالمساهمة الفنية للجلوريا A بينافيدس. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية 13PRE16390001 (SR)، NIH T32HL07918 (PAK)، NIH T32HL007457 (TM)، P30DK056336 (BKC)، مضاعفات السكري NIDDK اتحاد (DiaComp، www.diacomp.org) DK076169 منحة (subaward VDU)، ومركز اوبراين P30 DK079337 (VDU).

وقد تم استعراض كافة البروتوكولات وصفها في هذه المخطوطة لجمع الدم والعزلة والتحليل والتي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسساتي في جامعة ألاباما في برمنغهام. 1. عزل الخلية (معدلة من Histopaque سيغما الدريخ البروتوكول رقم 1119 وبيوتيك Miltenyi MicroBead إيجابي والبروتوكولات اختيار سلبي) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الدم الكامل (تم جمعها في ACD أو أنابيب EDTA) في 500 x ج لمدة 15 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار يتأرجح دلو (التسارع = 5-6، وليس الفرامل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطبقة العليا التي تحتوي على صفائح البلازما الغنية (الحزب الثورى) مع ماصة نقل حتى يبقى 1 سم فوق طبقة الخلايا (كرات الدم الحمراء معطف / ​​الشهباء). جانبا PRP في درجة حرارة الغرفة لتجهيز في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل معطف الشهباء لالعقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، وتمييع إلى 24 مل مع RPMI القاعدية أو إلى 4x على الأقل بدءا حجم معطف الشهباء. ملاحظة: في النصف العلوي من طبقة RBC قد حافي ليتم تضمينها على الرغم من أن هذا سيؤدي إلى زيادة حجم RPMI نسبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التدرج الكثافة ومنخفض الكثافة باستخدام Ficoll مع الثقل النوعي من 1.077 (1077) عن الطبقة العليا وارتفاع كثافة Ficoll مع الثقل النوعي من 1.119 (1119) عن الطبقة السفلى في ثلاثة أنابيب مخروطية 15 مل (3 مل لكل منهما). لتنفيذ هذه الخطوة، أولا إضافة 1077 إلى كل أنبوب. باستخدام 5 مل ماصة الضيقة إضافة 1119 إلى الجزء السفلي من الأنبوب من خلال وضع غيض ماصة تحت 1077 وببطء الافراج عن كاشف دون خلط مع التدرج العليا. وينبغي أن يكون ما مجموعه 6 مل من وسائل الإعلام التدرج الكثافة الحالية في هذه المرحلة مع مرحلة اضح عن الانفصال في 3 مل علامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الآلي، إضافة 8 مل من الدم المخفف (من الخطوة 1.3) بلطف إلى كل أنبوب التدرج باستخدام الإعداد الطاقة المنخفضة لمنع إزعاج من طبقات متدرجة. يجب أن يكون الحجم الكلي 14 مل في هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (accele6 التموينية، لا الفرامل). ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن يكون ثلاثة نطاقات خلية متميزة واضح (الشكل 1A). نطاقات العلوي (بين 1077 والبلازما) يحتوي على خلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) والصفائح الدموية، والفرقة الوسط (بين 1007 و 1119) يحتوي على خلايا النوى (PMNs) وانخفاض الفرقة (أقل من 1119) يحتوي على كرات الدم الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع MNC وPMN بشكل منفصل باستخدام ماصات زجاجية معقمة دون إزعاج نطاقات الخلايا الأخرى. الجمع بين السكان MNC من كل أنبوب إلى أنبوب 50 مل العقيمة المخروطية. كرر هذا للسكان PMN كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مجلدات من RPMI إلى كل أنبوب يحتوي على MNC وPMN الكسور على التوالي لتخفيف التدرج الكثافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend MNC بيليه الخلية والخلية بيليه PMN في 1 مل RPMI تحتوي على 0.5٪ نقي للغاية الدهنية خالية من حمض BSA (RPMI-BSA) ونقل إلى 1.5 مل أنابيب عقيمة. بيليه الخلايا باستخدام picofuge الفوق لمدة 30ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend كل بيليه الخلية في 80 ميكرولتر RPMI-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من حبة المغناطيسي المسمى antiCD14 الضد إلى الأنبوب الذي يحتوي على جزء MNC لاختيار إيجابية من وحيدات. للالأنبوب الذي يحتوي على جزء الخلية PMN، إضافة 20 ميكرولتر من حبة المغناطيسي المسمى antiCD15 الأجسام المضادة لاختيار إيجابية من العدلات. احتضان كل تعليق خلية لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل تعليق الخلية مع 1 مل سائل الإعلام RPMI-BSA وبيليه كما كان من قبل و resuspend كل بيليه في 500 ميكرولتر RPMI-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم فصل الخلايا المسمى في المجال المغناطيسي للخلية تنشيط الفرز المغناطيسي (MACS) فاصل. إعداد الأعمدة MACS LS (واحد لكل تعليق خلية) عن طريق وضع العمود على فاصل MACS والغسيل مع 3 مل من RPMI-BSA قبل إضافة تعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تطبيق الايقاف الخلية، وغسل كل عمود 3X مع 3 مل من RPMI-BSA سائل الإعلام (تأكد من السماح للدري وسائل الإعلامن تماما بين يغسل). جمع التعليق الخلية التدفق من خلال ويغسل العمود في أنبوب العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل حيدات والعدلات، وإزالة العمود من المجال المغناطيسي بعد غسل النهائي وأزل الخلايا المحددة بشكل إيجابي في أنبوب العقيمة مع 5 مل من RPMI-BSA باستخدام المكبس العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل الخلايا الليمفاوية بيليه جزء التدفق من خلال غسل من الشركات المتعددة الجنسيات من الخطوة 1.15 في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 80 ميكرولتر RPMI-BSA. إضافة 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD61 وCD235a واحتضان تعليق خلية لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. تكرار فصل MACS كما كان من قبل، وجمع تدفق الرغم تحتوي على الخلايا الليمفاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتكوير حيدات، العدلات، اللمفاويات والكسور، كما كان من قبل أجهزة الطرد المركزي (الخطوة 1.9) وتجاهل supernatants. يجب معلق الكريات الخلايا في 1 مل خارج الخلية تدفق وسائل الاعلام (XF-DMEM) لفرز الأصوات. &lt;ر /&gt; ملاحظة: يجب 8 مل من الدم الكامل يؤدي إلى 1-5 × 10 6 حيدات / مل، و5-20 × 10 6 الخلايا الليمفاوية والعدلات / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل الصفائح الدموية، الطرد المركزي PRP (الخطوة 1.2) لمدة 8-10 دقيقة في 1،500 XG في درجة حرارة الغرفة. إزالة البلازما ويغسل مرة واحدة مع بيليه الخلية معقمة 5 مل PBS تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل PGI 2، repellet وتعليق بيليه النهائي في 1 مل من برنامج تلفزيوني PGI 2 العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الصفائح الدموية عن طريق قياس العكر مرة واحدة وعلقت الصفائح الدموية في برنامج تلفزيوني PGI 2 العازلة معمل كما وصفها Walkowiak آخرون باستخدام المعادلة التالية: [6.23 / (2.016 - عبس 800)] - عامل التخفيف 3.09 س = # × 10 8. الصفائح الدموية / مل 12. </li></ol> 2. طلاء للخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلوي تاك (لاصق الخلية): إضافة 90 ميكرولتر خلية لاصقة إلى 180 ميكرولتر DIH 2 0، 540 ميكرولتر من 0.1 N ثنائي الصوديومكربونات (درجة الحموضة 8.0)، وضبط درجة الحموضة إلى 7،2-7،8 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم. إعداد لوحات XF (24 جيدا، V7 microplates) بواسطة طلاء كل جيدا مع 30 ميكرولتر من خلية لاصقة المعدة. ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا لاصقة خلية جديدة لكل استخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة ثم اللصق الخلية نضح ويغسل الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني (1 مل / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ عدد خلايا معزولة على حيدات، الخلايا الليمفاوية، والعدلات والصفيحات وتقديمهم إلى حجم مناسب باستخدام XF-DMEM للسماح كثافة البذر من 250K خلايا / جيد للحيدات، الخلايا الليمفاوية، والعدلات، و 25 × 10 6 / جيد لالصفائح الدموية. بدلا من ذلك، لقياس استجابة انفجار الأكسدة، العدلات يمكن المصنف في 125K خلايا / جيد. يجب أن يكون حجم بذر النهائي لكل ميكرولتر 200 تعليق خلية / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 200 x ج لمدة 1 ثانية مع عدم وجود الفرامل. تدوير لوحة 180 ˚ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى مع عدم وجود الفرامل في 300 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب المجلد جيدا النهائيأوميا إلى 660 ميكرولتر مع XF-DMEM واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل XF الفحص. ملاحظة: Photomicrographs الخلايا مطلي قبل وبعد الفحص يمكن استخدامها لضمان الطلاء الكافية ويستبعد مفرزة الخلية. </li></ol> 3. إعداد 24 جيدا خارج الخلية الجريان الفحص بلايت (XF24) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات XF يبحث مع حل calibrant مدة لا تقل عن 2 ساعة قبل الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10X مخزونات 0.5 ميكروغرام / مل أوليغوميسين، 0.6 ميكرومتر FCCP، و 10 ميكرومتر في antimycin A-XF DMEM وتحميل 75 ميكرولتر من الحلول الأسهم في الموانئ حقن خرطوشة في الترتيب أعلاه. إذا القياسات انفجار الأكسدة هي التي يمكن الحصول عليها، حقن 10X الأسهم من 100 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية يمكن حقنها بعد antimycin-A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة خرطوشة رطب وتحميلها وتنفيذ أعمال الفحص XF. وقد وصفت وسائل تفصيلية لتحليل وتفسير التغيرات سواء استهلاك الأوكسجين ودرجة الحموضة في المنشورات السابقة 9،13،14 ولا دiscussed في التفاصيل هنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد XF مقايسة، ونضح جميع ولكن 50 ميكرولتر من مشاركة XF-DMEM بعد الفحص لمنع فقدان الخلايا من لوحة وإضافة 50 ميكرولتر العازلة RIPA تحلل الخلية وإجراء فحص البروتين للتطبيع. </li></ol>

<ol>
	<li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cognitive+impairment,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease.</a> Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).</li><li>Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+mitochondrial+quality+control,+and+oncogenesis.">Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis.</a> Autophagy. 2, 80-84 (2006).</li><li>Cordero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+mitophagy+activation+in+blood+mononuclear+cells+of+fibromyalgia+patients:+implications+in+the+pathogenesis+of+the+disease.">Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease.</a> Arthritis Res. Ther. 12, R17 (2010).</li><li>Japiassu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+failure+of+human+peripheral+blood+monocytes+in+patients+with+septic+shock+is+mediated+by+reduced+F1Fo+adenosine-5'-triphosphate+synthase+activity.">Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity.</a> Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).</li><li>Widlansky, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+membrane+potential,+mass,+and+morphology+in+the+mononuclear+cells+of+humans+with+type+2+diabetes.">Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes.</a> Transl. Res. 156, 15-25 (2010).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ageing+and+Alzheimer's+disease+on+mitochondrial+function+of+human+platelets.">Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets.</a> Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).</li><li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins.">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).</li><li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy.">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).</li><li>Hultqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autoimmunity,+arthritis,+and+encephalomyelitis+in+mice+with+a+reduced+oxidative+burst+due+to+a+mutation+in+the+Ncf1+gene.">Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).</li><li>Rosa-Borges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency+with+recurrent+infections:+case+report.">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report.</a> J. Ped. 77, 331-336 (2001).</li><li>Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+reader--a+convenient+tool+in+studies+of+blood+coagulation.">Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation.</a> Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).</li></ol>

VDU هو عضو في المجلس الاستشاري العلمي العلوم البيولوجية فرس البحر.

يمثل هذا البروتوكول تجميع عدة تقنيات تستخدم عادة لعزل خلايا الدم بطريقة مناسبة لتحليل الطاقة الحيوية. تقنيات متجاورة قدمت هي مفيدة لأساليب العزل الأخرى (أي تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية) لقدرتها على عزل أعداد كبيرة من الخلايا في ظروف وسائل الإعلام التي تسيطر عليها مع الحد الأدنى من الضغوط المفروضة على خلايا معزولة. فمن لديه عيب العزلة المطولة حتى مع الحد الأدنى من انقطاع. يخدم هذا البروتوكول كأساس لعزل خلايا الدم الأولية من بالكائن البشري، والتي يمكن استقراء في إعدادات السريرية والبحوث متعدية. MACS الانفصال هو موثوق بها تقنية عزل الخلية التي توفر إمكانية عزل الخلايا مباشرة من الدم الكامل، ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب كميات أكبر من الأجسام المضادة وليس الأمثل لعزل جميع أنواع الخلايا متميزة أربعة كما هو موضح في هذا الأسلوب. لديه هناك بالتابعين أي دليل لإثبات أن اختيار إيجابية من الكريات البيض التي كتبها نتائج الانفصال MACS في التنشيط باستخدام بروتوكول عزلتنا. الأعمدة MACS تعمل بواسطة امتصاص الخلايا المسمى في مجال مغناطيسي باستخدام الأجسام المضادة مترافق إلى 50 جزيئات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic نانومتر. ثم يتم مزال الخلايا المسمى قبالة العمود. يتم تطبيق الاختيارات الإيجابية والسلبية في هذا البروتوكول لضمان العزلة السريع والنقاء. إذا تم الحصول على عدم كفاية أعداد الخلايا من العزلة أو النقاء هو في السؤال، وأكثر الأجسام المضادة يمكن أن تضاف إلى العينة وفقا لتعليمات البائع والمقطع الثاني من خلال العمود LS قد يؤدي إلى مزيد من النقاء (الجدول 2). وجدت لدينا مختبر نقاء عالية وكفاءة الطلاء باستخدام بروتوكول القائمة من خلال تحليل الايقاف الخلية النهائي عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية 8. تحليل تدفق خارج الخلية لديها القدرة على رصد كل استهلاك الأوكسجين وتحمض وسائل الإعلام في الوقت الحقيقي على ذلك من بعد التمديدالأقطاب الكهربائية لها. استهلاك الأكسجين كما لوحظ من قبل استجابة التأكسدي انفجر في وحيدات والعدلات هو NADPH أوكسيديز تعتمد كما هو موضح عن طريق تثبيط مع DPI 8. شهدنا الوقت فقدان القدرة تعتمد في انفجار التأكسدي مع العزلة لفترات طويلة أو المقايسات XF الموسعة. وقد تم تصميم هذا البروتوكول وضعت للاستخدام على XF24 ولكن هو أيضا متوافقة مع XF96 في حوالي ثلث إلى نصف واحد من الخلية XF24 بذر الكثافة (الشكل 3). في تصميم هذا البروتوكول، وكان مطلوبا الالتزام البروتوكولات القائمة لكل تقنية لتحقيق الأداء الأمثل مع التعديلات التي أدخلت فقط للسيطرة على الأوضاع وسائل الإعلام لتحليل الطاقة البيولوجية. بعد اتقان التقنيات، مثل بروتوكول يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات والبحوث متعدية لقياس السمية أو فعالية استراتيجيات العلاج، واستكشاف الخصائص الأيضية من المرض، والإنتاج أكسدة بواسطة الوحيدات ونيوتrophils في حالات الالتهابات.

مراقبة صحة الطاقة البيولوجية للخلايا المناعية (وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات) والصفائح الدموية من الدم وقد اعترف لبعض الوقت كأداة تشخيصية يمكن أن تكون مفيدة لتقييم صحة الطاقة البيولوجية الشاملة للفرد. هناك هيئة الناشئة الأدب وعزا عدد من الأمراض مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية وأمراض الاعصاب لضعف الميتوكوندريا 1،2. هذا هو المهم سريريا منذ ضعف الميتوكوندريا يمكن الشروع في سلسلة من الأحداث الخلوية التي تعزز مسارات الإشارات الموالية للالتهابات أو تؤدي إلى موت الخلية. وتتميز العديد من الدراسات وظيفة الميتوكوندريا من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى والصفائح الدموية في ظروف مثل فيبروميالغيا، ومرض السكري، والصدمة الإنتانية، ومرض الزهايمر 3-7. على سبيل المثال، تقييم دراسة حديثة أن الطاقة الحيوية من الصفائح الدموية كعلامة من أجل وظيفة الميتوكوندريا وجدت أن الصفائح الدموية من النوع 2 DIABETقد المرضى جيم تقلص الميتوكوندريا 7،8 استهلاك الأوكسجين. من هذه النتائج وغيرها، فمن الواضح أن وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات، والصفائح الدموية يمكن أن تكون علامات بديلة وذلك اعتبارا من التغيرات في الطاقة الحيوية في ظل ظروف مرضية لأنها مسح جهاز الدورة الدموية ويمكن أن تعكس التغيرات الأيضية المحلية والعالمية. لتحديد ما إذا كان هذا النهج له قيمة النذير أو التشخيص طريقة إنتاجية عالية من التحليل وكان المطلوب هو طريقة متسقة لإعداد الخلية. الأساليب لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الكريات البيض والصفيحات الدموية وقد شاركت سابقا عزل الميتوكوندريا أو تقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا سليمة 4،9. الاستفادة من تقييم الطاقة البيولوجية الخلوية باستخدام تدفق خارج الخلية (XF) محلل هو أن وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا يمكن أن تنشأ مع ركائز الذاتية والمعلمات الجهاز التنفسي مثل تسرب بروتون والجهاز التنفسي القصوىيمكن تحديد القدرات. نحن وغيرنا قد استخدمت هذه التكنولوجيا لإظهار أن ملامح الطاقة البيولوجية في الصفائح الدموية، وحيدات الخلايا اللمفية المعزولة من الدم البشري يمكن أن تنشأ ومقارنة بين أنواع الخلايا 8. بالإضافة إلى ذلك، كل من العدلات وحيدات تمتلك قدرة التأكسدي في انفجار التي يتم تنشيطها oxidases NAPDH وتستهلك الأكسجين لتشكيل الفائق. الأهم من ذلك، هذا المسار هو عنصر أساسي من المناعة الفطرية والالتهابات الجهازية عن طريق التضمين. على سبيل المثال، فقد تبين أن ترتبط التغييرات في قدرة التأكسدي انفجار مع مختلف أمراض المناعة الذاتية مثل التصلب المتعدد، والتهاب المفاصل، والالتهابات المتكررة 10،11. حاليا لا توجد إنتاجية عالية المقايسات الكمية المتوفرة لقياس انفجار التأكسدي في العينات السريرية. هذا أمر مهم لأن تميز قدرة التأكسدي انفجار العدلات وحيدات قد تخدم أيضا كأداة تشخيصية هامة لعدة patholoخيس. كانت التحديات التقنية الرئيسية انخفاض الحساسية لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام تقنيات تخطيط الاستقطاب التقليدية والحاجة إلى استخدام الخلايا المرفقة عند استخدام تقنيات صفيحة ميكروسكوبية فلوروميتريك أكثر حساسية. في هذا الفيديو عملية، ونحن تصف حل تقني لهذه المشاكل. نحن بالتفصيل الأساليب لعزل، والطلاء وقياس الطاقة الحيوية من وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات، والصفائح الدموية وانفجار التأكسدي من وحيدات والعدلات من الدم البشري، وهذا الأسلوب هو مناسبة لتقييم السريرية من الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار للمحققين أن يكون الوصول إلى السكان المريض والقدرة على الحصول على عينات دماء جديدة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-094-833</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"><a name="RANGE!A3">CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human</a></td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-501</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD61 MicroBeads, human&#160; for platelets</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-051-101</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD14 MicroBeads, human&#160; for monocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-201</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD15 MicroBeads, human&#160; for granulocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-046-601</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">LS Columns</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-042-401</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">BD Vacutainer ACD Blood collection tubes</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">02-684-26</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">11835-030</td>
			<td style="width:215px;">with L-glutamine and without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Prostaglandin I2, sodium salt</td>
			<td style="width:215px;">Cayman</td>
			<td style="width:215px;">18220</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">1.5 ml semi-micro cuvettes</td>
			<td style="width:215px;">Phenix Research Products</td>
			<td style="width:215px;">SC-2410</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.077</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">10771</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.119</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">11191</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:215px;">Roche</td>
			<td style="width:215px;">3117405001</td>
			<td style="width:215px;">fatty-acid ultra-free</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8139</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">100850-001</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">MT90113PB</td>
			<td style="width:215px;">w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">L-Glutamine, 200mM (100x)</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:215px;">25030-081</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">G7528</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8574</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Cell-Tak (cell adhesive)</td>
			<td style="width:215px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">CB-40242</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">O4876</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A8674</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C-2920</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent A</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0113</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent S</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0015</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent B</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0114</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Vendor</td>
			<td style="width:215px;">Product #</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Seahorse</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-090-976 and 24039</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets

ومن المعروف ضعف الميتوكوندريا أن تلعب دورا هاما في عدد من الحالات المرضية مثل تصلب الشرايين، والسكري، والصدمة الإنتانية، والأمراض العصبية ولكن تقييم التغيرات في وظيفة الطاقة البيولوجية في المرضى الذين يعانون من التحدي. على الرغم من أن الأمراض مثل السكري أو تصلب الشرايين الحاضر سريريا مع ضعف الجهاز محددة، مكونات النظامية من الأمراض، مثل ارتفاع السكر في الدم أو التهاب، ويمكن تغيير وظيفة الطاقة البيولوجية في تعميم الكريات البيض أو الصفائح الدموية. وقد اعترف هذا المفهوم لبعض الوقت ولكن تم تقييد التطبيق على نطاق واسع من قبل عدد كبير من الخلايا الأولية اللازمة لتحليل الطاقة البيولوجية. وقد تم التغلب على هذا القيد من خلال الجمع بين التقنية خصوصية تقنيات حبة العزل المغناطيسي، وتقنيات التصاق الخلية، والتي تسمح للخلايا لضمها دون تفعيل لmicroplates، وحساسية من التكنولوجيات الجديدة مصممة للإنتاجية عالية هيئة التصنيع العسكريقياس التنفس roplate. مثال على هذه المعدات هو محلل تدفق خارج الخلية. يستخدم مثل هذه الأجهزة عادة الأكسجين ودرجة الحموضة تحقيقات حساسة لقياس معدلات التغير في هذه المعلمات في الخلايا الملتصقة، ومن ثم يمكن المتعلقة الأيض. نحن هنا من التفصيل الطرق لعزل وطلاء من وحيدات، الخلايا الليمفاوية، والعدلات والصفيحات، من دون تفعيل، من الدم البشري وتحليل وظيفة الميتوكوندريا الطاقة البيولوجية في هذه الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، ونحن لشرح كيفية التأكسدي انفجر في وحيدات والعدلات ويمكن أيضا أن يقاس في نفس العينات. منذ استخدام هذه الأساليب فقط 8-20 مل دم الإنسان لديهم إمكانات لرصد الجيل أنواع الاكسجين التفاعلية والطاقة الحيوية في عملية إعداد سريرية.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets at JoVE.com

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

الكريات البيض في الدم والصفائح الدموية ويمكن أن تستخدم كعلامة للصحة الطاقة البيولوجية الشاملة للفرد وذلك لديها القدرة على رصد العمليات المرضية وتأثير العلاجات. نحن هنا تصف طريقة لعزل وقياس وظيفة الميتوكوندريا وانفجار التأكسدي في هذه الخلايا.

الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

بروتوكولات للتحقيق في توزيع الأنسجة المضيف، نقل واسطة، وتأثير ذلك على الرشاقة المضيف من Densovirus في دودة اللوز القطن

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في تاليانا العربيدوبسي

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...