Name: bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets
Uploaded: 2014-03-27T21:00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות על התרומה הטכנית של גלוריה נאווידס. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), סיבוכי NIDDK סוכרתיים Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) DK076169 מענק (VDU subaward), וDK079337 אובריאן מרכז P30 (VDU).

כל הפרוטוקולים שתוארו בכתב היד הזה לאיסוף דם, בידוד וניתוח כבר נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון סקירה המוסדי באוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם. 1. בידוד תא (השתנה מHistopaque סיגמא אולדריץ פרוטוקול מס 1119 וMiltenyi יוטכנולוגיים microbead חיובי ופרוטוקולי סלקציה שליליים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם צנטריפוגה כולו (שנאסף בACD או צינורות EDTA) בשעה XG 500 במשך 15 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור מתנדנד דלי (תאוצה = 5-6, ולא בלם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את השכבה העליונה המכילה פלזמה העשירה טסיות (PRP) עם טפטפת העברה עד 1 סנטימטר נשאר מעל שכבת התאים (מעיל כדורית אדומה / באפי). מניח בצד PRP בטמפרטורת חדר לעיבוד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המעיל באפי לצינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי, לדלל ל24 מיליליטר עם RPMI הבסיסי או לפחות 4x מתחיל באפי מעיל הנפח. הערה: חיצו העליון של שכבת RBC עשוי have להיכלל אם כי זה יגרום להגדלת נפח RPMI באופן יחסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שיפוע הצפיפות באמצעות צפיפות נמוכה Ficoll עם משקל סגולי של 1.077 (1077) לשכבה העליונה וFicoll צפיפות הגבוהה עם משקל סגולי של 1.119 (1119) לשכבה התחתונה בשלושה צינורות 15 מיליליטר חרוטי (3 מיליליטר כל אחד). כדי לבצע שלב זה, להוסיף ראשון 1077 לצינור אחד. בעזרת פיפטה צרה 5 מיליליטר להוסיף 1119 לחלק התחתון של הצינור על ידי הצבת קצה פיפטה מתחת 1077 ולאט לאט לשחרר מגיב ללא ערבוב עם השיפוע העליון. סכום כולל של 6 מיליליטר של תקשורת שיפוע צפיפות צריך להיות נוכח בשלב זה עם שלב גלוי של הפרדה בסימן מיליליטר 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה אוטומטית, להוסיף 8 מיליליטר של דם מדולל (משלב 1.3) בעדינות על צינור אחד שיפוע באמצעות הגדרת צריכת החשמל הנמוך כדי למנוע מלהפריע לשכבות הצבע. הנפח הכולל צריך להיות 14 מיליליטר בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה ב XG 700 ל30 דקות בטמפרטורת חדר (acceleמנה 6, לא בלם). הערה: בשלב זה, שלוש להקות תא נפרדות צריכים להיות (איור 1 א) מאליו. הלהקות העליונות (בין 1077 ופלזמה) מכילה תאים חד גרעיניים (MNC) וטסיות דם, והלהקה באמצע (בין 1007 ו1119) מכיל תאי polymorphonuclear (PMNs) ורצועה תחתונה (מתחת 1119) מכיל תאי דם אדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את MNC וPMN בנפרד באמצעות טפטפות זכוכית סטרילית מבלי להפריע להקות תא האחרות. לשלב את אוכלוסיית MNC מצינור לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי. חזור על פעולה זו עבור אוכלוסיית PMN גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 כרכים של RPMI על צינור אחד המכיל את השברים MNC וPMN בהתאמה לדלל את שיפוע הצפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה ב XG 700 ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה resuspend MNC תא ותא גלולה PMN בRPMI 1 מיליליטר מכיל 0.5% אולטרה טהור שומן נטול חומצת BSA (RPMI-BSA) ולהעביר לסטרילי 1.5 צינורות מיליליטר. גלולה התאים באמצעות picofuge המעבדתיים ל30שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend כל גלולה תא ב80 μl RPMI-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של נוגדן שכותרת antiCD14 חרוז המגנטי לצינור המכיל את חלק MNC לסלקציה חיובית של מונוציטים. לצינור המכיל את החלק היחסי של תאי PMN, להוסיף 20 μl של נוגדן שכותרת antiCD15 חרוז המגנטי לסלקציה חיובית של נויטרופילים. דגירה כל השעיה תא ל15 דקות ב 4 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל השעיה תא עם 1 מיליליטר תקשורת RPMI-BSA וגלולה כמו קודם וresuspend כל גלולה ב500 μl RPMI-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי שכותרתו מופרדים בשדה המגנטי של תא מגנטי מיון הפעיל מפריד (MACS). הכן את עמודות LS MACS (אחד לכל השעיה תא) על ידי הצבת הטור על מפריד MACS וכביסה עם 3 מיליליטר של RPMI-BSA לפני הוספת ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החלת השעיות תא, לשטוף כל עמודה 3x עם 3 מיליליטר של תקשורת RPMI-BSA (לוודא לתת דראי התקשורתn בין שוטף לחלוטין). אסוף את ההשעיה תא זרימה דרך שטיפות עמודה לתוך צינור סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד מונוציטים ונויטרופילים, להסיר את העמודה מהשדה המגנטי לאחר לשטוף הסופי וelute התאים חיובי שנבחרו לתוך צינור סטרילי עם 5 מיליליטר של RPMI-BSA באמצעות בוכנת העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד ימפוציטים גלולה שבריר זרימה דרך השטיפה של MNCs מצעד 1.15 XG 300 10 דקות. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 80 RPMI-BSA. הוסף 20 μl של נוגדני CD61 וCD235a דגירה תא השעיה ל15 דקות ב 4 º C. חזור על הפרדת MACS כמו קודם ולאסוף את הזרימה למרות שמכיל לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי גלולה מונוציטים, נויטרופילים, ושברים לימפוציטים, צנטריפוגות כמו קודם (שלב 1.9) וזורקים supernatants. כדורי תא צריכים להיות מושעים ב 1 מיליליטר תאי שטף תקשורת (XF-DMEM) לספירה. &lt;br /&gt; הערה: 8 מיליליטר של דם מלא צריך לגרום 1-5 x 10 6 מיליליטר מונוציטים / ו5-20 x 10 ימפוציטים 6 ונויטרופילים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד טסיות דם, PRP צנטריפוגה (שלב 1.2) עבור 8-10 דקות ב 1,500 XG בטמפרטורת חדר. הסר את הפלזמה ולשטוף תא גלולה פעם אחת עם 5 מיליליטר סטרילי PBS בתוספת 1 ​​מיקרוגרם / מיליליטר PGI 2, repellet ולהשעות גלולה סופית ב 1 מיליליטר של PBS-PGI חיץ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ספירת הטסיות על ידי turbidimetry פעם טסיות מושעות ב-PBS-PGI חיץ 2 על ידי ספקטרופוטומטר כפי שתוארו על ידי Walkowiak אח&#39; באמצעות המשוואה הבאה: [6.23 / (2.016 - אבס 800)] - 3.09 גורם לדילול x = # x 10 8. טסיות דם / מיליליטר 12. </li></ol> 2. ציפוי של התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Cell-Tak (דבק תא): הוסף דבק תא 90 μl 180 μl diH 2 0, 540 μl של 0.1 N דו נתרןקרבונט (pH 8.0), ולהתאים את ה-pH ל 7.2-7.8 באמצעות 1 N NaOH. הכן את צלחות XF (24 גם, V7 microplates) על ידי ציפוי היטב עם כל 30 μl של דבק תא מוכן. הערה: דבק התא צריך להיות מוכן טרי לכל שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת על 37 º C ל20-30 אז דבק תא לשאוב דקות ולשטוף בארות עם PBS פעמיים (1 מיליליטר / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים במונוציטים המבודדים, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם ומביא לנפח מתאים באמצעות XF-DMEM כדי לאפשר צפיפות זריעה של 250k תאים / גם למונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים ו, ו25 x 10 6 / גם לטסיות דם. לחלופין, כדי למדוד את תגובת פרץ חמצוני, ניתן זורעים הנויטרופילים ב125k תאים / היטב. זריעת הנפח הסופי עבור כל השעיה תא צריך להיות 200 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב XG 200 ל1 שניות ללא בלם. סובב את הצלחת 180 ˚ ו צנטריפוגות שוב עם בלם לא ב300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא כרך גם סופיUme ל660 μl עם XF-DMEM ולדגור על 37 º C למשך 30 דקות לפני assay XF. הערה: Photomicrographs של תאים מצופים לפני ואחרי assay יכול לשמש כדי להבטיח ציפוי הולם ולשלול ניתוק תא. </li></ol> 3. הכנת 24 גם פלייט התאי השטף Assay (XF24) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה XF בדיקות עם פתרון calibrant למינימום של 2 שעות לפני assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10x מניות של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר oligomycin, 0.6 מיקרומטר FCCP, ו10 מיקרומטר antimycin בXF-DMEM ועומס 75 μl של פתרונות מניות ליציאות הזרקת דיו בצו הנ&quot;ל. אם מדידות פרץ חמצוני הן שיתקבל, הזרקה של 10x המניה של 100 PMA מיליליטר / ng ניתן להזריק אחרי antimycin-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את מחסנית התייבשות וטעונה ולבצע את assay XF. השיטות מפורטות לניתוח ופרשנות של שינויים הן את צריכת החמצן וחומציות תוארו בפרסומים קודמים 9,13,14 ואינם דiscussed בפירוט כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay XF, לשאוב את כל אבל 50 μl האחרון של XF-DMEM אחרי assay כדי למנוע אובדן של תאים מהצלחת ולהוסיף 50 מאגר תמוגה תא μl הריף ולבצע assay חלבון לנורמליזציה. </li></ol>

<ol>
	<li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cognitive+impairment,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease.</a> Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).</li><li>Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+mitochondrial+quality+control,+and+oncogenesis.">Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis.</a> Autophagy. 2, 80-84 (2006).</li><li>Cordero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+mitophagy+activation+in+blood+mononuclear+cells+of+fibromyalgia+patients:+implications+in+the+pathogenesis+of+the+disease.">Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease.</a> Arthritis Res. Ther. 12, R17 (2010).</li><li>Japiassu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+failure+of+human+peripheral+blood+monocytes+in+patients+with+septic+shock+is+mediated+by+reduced+F1Fo+adenosine-5'-triphosphate+synthase+activity.">Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity.</a> Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).</li><li>Widlansky, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+membrane+potential,+mass,+and+morphology+in+the+mononuclear+cells+of+humans+with+type+2+diabetes.">Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes.</a> Transl. Res. 156, 15-25 (2010).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ageing+and+Alzheimer's+disease+on+mitochondrial+function+of+human+platelets.">Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets.</a> Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).</li><li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins.">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).</li><li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy.">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).</li><li>Hultqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autoimmunity,+arthritis,+and+encephalomyelitis+in+mice+with+a+reduced+oxidative+burst+due+to+a+mutation+in+the+Ncf1+gene.">Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).</li><li>Rosa-Borges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency+with+recurrent+infections:+case+report.">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report.</a> J. Ped. 77, 331-336 (2001).</li><li>Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+reader--a+convenient+tool+in+studies+of+blood+coagulation.">Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation.</a> Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).</li></ol>

VDU הוא חבר של סוסון ים Bioscience המדעי המייעץ.

פרוטוקול זה מייצג את האוסף של כמה טכניקות מנוצלים בדרך כלל לבידוד תאי דם באופן מתאים לניתוח bioenergetics. הטכניקות רציפות שהוצגו הן יתרון לשיטות אחרות בידוד (כלומר ניתוח FACS) ליכולת שלהם לבודד מספר גדול של תאים בתנאי תקשורת מבוקרים עם לחצים מינימאליים מונחים על התאים המבודדים. יש לו את החסרון של בידודים ממושכים גם עם הפרעות מינימליות. פרוטוקול זה משמש כבסיס לבידוד של תאי דם עיקריים מבני אדם, שניתן להסיק להגדרות קליניות ומחקר translational. הפרדת MACS היא טכניקת בידוד תא אמינה שמציעה את האפשרות של בידוד תאים ישירות מדם כולו, עם זאת, שיטה זו דורשת כמויות גדולות יותר של נוגדנים ואינה אופטימלי לבידוד של כל ארבעת סוגי התאים שונים כפי שמתוארים בשיטה זו. שם יש בeen אין ראיות כדי להראות שהסלקציה החיובית של לויקוציטים ידי תוצאות הפרדת MACS בהפעלה באמצעות פרוטוקול הבידוד שלנו. עמודות MACS לפעול באמצעות קיבוע של תאים שכותרתו בשדה מגנטי באמצעות נוגדנים מצומדות כדי 50 חלקיקי פאראמגנטי ננומטר. לאחר מכן תאים שכותרתו eluted את הטור. בחירות חיוביות ושליליות מיושמות בפרוטוקול זה כדי להבטיח בידוד וטוהר מהירים. אם מספרי תא לקויים מתקבלים מבידוד או טוהר הוא בשאלה, ניתן להוסיף יותר נוגדנים למדגם לפי ההוראה של הספק והמעבר שני דרך עמודת LS עלול לגרום לטוהר גבוה יותר (טבלה 2). המעבדה שלנו מצאה טוהר גבוה ויעילות ציפוי באמצעות הפרוטוקול הקיים על ידי ניתוח השעיות תא סופיים על ידי ניתוח FACS 8. יש מנתחי שטף תאיים היכולת לפקח גם צריכת חמצן והחמצת תקשורת בזמן אמת מעל זה של otאלקטרודות. צריכת החמצן כפי שנצפה על ידי תגובת פרץ חמצוני במונוציטים ונויטרופילים היא מונואמין NADPH תלוי כפי שמוצג על ידי עיכוב עם DPI 8. שראינו בהפסד תלוי בזמן בקיבולת פרץ חמצוני עם בידודים ממושכים או מבחני XF מורחבים. פרוטוקול זה תוכנן ופותחו לשימוש בXF24 אבל גם תואם עם XF96 כבשליש עד חצי מהתא XF24 זריעת צפיפות (איור 3). בעיצוב של פרוטוקול זה, היצמדות לפרוטוקולים קיימים עבור כל טכניקה הנדרשת לביצועים אופטימליים עם שינויים שנעשו אך ורק כדי לשלוט בתנאי תקשורת לניתוח bioenergetic. לאחר שליטה בטכניקות, פרוטוקול כזה יכול לשמש במגוון רחב של יישומי translational ומחקר כדי למדוד את הרעילות או יעילות של אסטרטגיות טיפול, לחקור מאפיינים המטבולי של מחלה, וייצור חמצון על ידי מונוציטים וneutrophils במצבים דלקתיים.

ניטור בריאות bioenergetic של תאים חיסוניים (מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים) וטסיות דם מהוכר במשך זמן מה ככלי אבחון שעשוי להיות שימושיים כדי להעריך את בריאות bioenergetic הכללית של אדם. יש גוף מתעוררים של ספרות מייחס מספר המחלות כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם ומחלות ניווניות ל1,2 תפקוד המיטוכונדריה. זה חשוב מבחינה קלינית מאז תפקוד המיטוכונדריה יכול ליזום סדרה של אירועים הסלולר שיקדמו מסלולי איתות הפרו דלקתיים או להוביל למוות של תאים. מספר מחקרים מאופיינים תפקוד המיטוכונדריה של תאים היקפיים mononuclear הדם וטסיות דם במצבים כגון פיברומיאלגיה, סוכרת, הלם ספטי, והמחלה 3-7 אלצהיימר. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה העריך את bioenergetics של טסיות דם כסמן לתפקוד המיטוכונדריה ומצא כי טסיות דם מסוג 2 Diabetחולי ic פחתו 7,8 צריכת החמצן במיטוכונדריה. מממצאים אלה ואחרים, ברור שמונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים, וטסיות דם יכולים לשמש כסמנים פונדקאיות כשינויים בbioenergetics תחת מצבים פתולוגיים שכן הם יסקור את מחזור הדם המערכתי ועשויים לשקף שינויים מטבוליים מקומיים והעולמיים. כדי לקבוע אם גישה זו יש ערך פרוגנוסטי או אבחון בשיטת תפוקה גבוהה של ניתוח ושיטה עקבית להכנת תא נדרשת. השיטות כדי למדוד את התפקוד המיטוכונדריה בלויקוציטים וטסיות דם שמעורבים בעבר בידוד של המיטוכונדריה או הערכה של bioenergetics הסלולר בתאים שלמים 4,9. היתרון של הערכת bioenergetic הסלולרית באמצעות שטף תאי מנתח (XF) הוא שהפונקציה של המיטוכונדריה בתאים ניתן להקים עם מצעי אנדוגני ופרמטרי נשימה כגון דליפת פרוטון ונשימה מקסימליקיבולת ניתן לקבוע. אנו ואחרים השתמשו בטכנולוגיה זו כדי להראות שפרופילי bioenergetic בטסיות דם, ניתן להקים מונוציטים ולימפוציטים מבודדים מהדם של בני אדם והשוואה בין סוגי תאים 8. בנוסף, שניהם נויטרופילים ומונוציטים בעלי קיבולת פרץ חמצוני בי oxidases NAPDH מופעלים וצורכים חמצן ליצירת superoxide. חשוב מכך, מסלול זה הוא מרכיב מרכזי של חסינות מולדת, והוא מווסת על ידי דלקת מערכתית. לדוגמא, זה כבר הראה כי שינויים בקיבולת פרץ חמצוני קשורים עם מחלות אוטואימוניות שונות, כגון טרשת נפוצה, דלקת פרקים, וזיהומים חוזרים ונשנים 10,11. כרגע אין מבחני כמותיים תפוקה גבוהה זמינים כדי למדוד את פרץ חמצוני בדגימות קליניות. זה חשוב מכיוון שמאפיין את קיבולת פרץ חמצוני של נויטרופילים ומונוציטים יכולים גם לשמש ככלי אבחונים חשובים מכמה patholoחיס. האתגרים הטכניים המפתח היו רגישות נמוכה למדידה של צריכת חמצן תוך שימוש בטכניקות polarographic קונבנציונליות ואת הצורך להשתמש בתאים מצורפים בעת שימוש בטכניקות fluorometric microplate רגישות יותר. בסרטון מעשי זה, אנו מתארים את הפתרון הטכני לבעיות אלו. אנחנו פירוט השיטות לבידוד, ציפוי והמדידה של bioenergetics של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים, וטסיות דם ופרץ חמצוני של מונוציטים ונויטרופילים מהדם אנושי. שיטה זו מתאימה להערכה קלינית של bioenergetics ופרץ חמצוני לחוקרים שיש להם גישה לאוכלוסייה מטופלת ואת היכולת להשיג דגימות דם טריות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-094-833</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"><a name="RANGE!A3">CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human</a></td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-501</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD61 MicroBeads, human&#160; for platelets</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-051-101</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD14 MicroBeads, human&#160; for monocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-201</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD15 MicroBeads, human&#160; for granulocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-046-601</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">LS Columns</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-042-401</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">BD Vacutainer ACD Blood collection tubes</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">02-684-26</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">11835-030</td>
			<td style="width:215px;">with L-glutamine and without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Prostaglandin I2, sodium salt</td>
			<td style="width:215px;">Cayman</td>
			<td style="width:215px;">18220</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">1.5 ml semi-micro cuvettes</td>
			<td style="width:215px;">Phenix Research Products</td>
			<td style="width:215px;">SC-2410</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.077</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">10771</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.119</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">11191</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:215px;">Roche</td>
			<td style="width:215px;">3117405001</td>
			<td style="width:215px;">fatty-acid ultra-free</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8139</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">100850-001</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">MT90113PB</td>
			<td style="width:215px;">w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">L-Glutamine, 200mM (100x)</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:215px;">25030-081</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">G7528</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8574</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Cell-Tak (cell adhesive)</td>
			<td style="width:215px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">CB-40242</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">O4876</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A8674</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C-2920</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent A</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0113</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent S</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0015</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent B</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0114</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Vendor</td>
			<td style="width:215px;">Product #</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Seahorse</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-090-976 and 24039</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets

תפקוד המיטוכונדריה ידוע לשחק תפקיד משמעותי במספר מצבים פתולוגיים כגון טרשת עורקים, סוכרת, הלם ספטי, ומחלות ניווניות אך הערכת שינויים בתפקוד bioenergetic בחולים מאתגרת. למרות שמחלות כמו סוכרת או טרשת עורקים הנוכחית קליניות עם ליקוי איבר מסוים, רכיבים מערכתיים של פתולוגיה, כגון היפרגליקמיה או דלקת, יכולים לשנות את תפקוד bioenergetic במחזור לויקוציטים או טסיות דם. תפיסה זו זכתה להכרה לכמה זמן, אבל היישום הנרחב שלה כבר מוגבל על ידי המספר הגדול של תאים ראשוניים הנדרשים לניתוח bioenergetic. מגבלה טכנית זו כבר להתגבר על ידי שילוב ספציפי של הטכניקות מגנטי בידוד חרוז, טכניקות הידבקות תא, המאפשרות לתאים שיצורפו ללא הפעלה לmicroplates, והרגישות של טכנולוגיות חדשות המיועדות למיקרופון תפוקה גבוההrespirometry roplate. דוגמא לציוד זה היא מנתח השטף תאי. מכשור כזה משתמש בדרך כלל בדיקות רגישות חמצן וה-pH למדידת שיעורי השינוי בפרמטרים האלה בתאים חסיד, אז מה שיכול להיות קשור לחילוף חומרים. כאן אנו מפרטים את השיטות לבידוד והציפוי של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם, ללא הפעלה, מהדם של בני אדם והניתוח של תפקוד bioenergetic המיטוכונדריה בתאים אלה. בנוסף, אנו מדגימים כיצד חמצוני פרצו במונוציטים ונויטרופילים יכולים גם להימדד בדגימות אותו. מאז שיטות אלה להשתמש רק 8-20 מיליליטר דם אדם שיש להם פוטנציאל לניטור דור חמצן מגיב מינים וbioenergetics בסביבה קלינית.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets at JoVE.com

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

כדוריות דם לבנות וטסיות דם יכולים לשמש כסמן לבריאות bioenergetic הכללי של אדם ולכן יש לו את הפוטנציאל לפקח על תהליכים פתולוגיים ואת ההשפעה של טיפולים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולמדוד את תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני בתאים אלה.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

פרוטוקולים לחקירת הפצת Host-הרקמה, הילוכים-mode, ואת ההשפעה על כושר Host של Densovirus ב bollworm הכותנה

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...