Name: longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

نحن نعترف بامتنان تقاسم المصادر المفتوحة من MATLAB تتبع الجسيمات رمز تقدمها ماريا Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> )، جنبا إلى جنب مع رمز IDL في وقت سابق وثائق واسعة النطاق التي تقدمها جون كروكر واريك أسابيع R.. وقدم هذا العمل ممكن بتمويل من المعهد الوطني للسرطان (لجنة التحقيق الوطنية / NIH)، وK99CA155045 R00CA155045 (PI: JPC).

1. الأجسام الشبه الكروية التثقيف ورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 10 مل من الماء خلية ثقافة الصف مع 0.1 غرام من الاغاروز للحصول على حل الاغاروز 1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة الحل الاغاروز إلى فوق 70 درجة مئوية (حوالي 14 ثانية في الميكروويف ?...

في هذا البروتوكول نقدم استراتيجية قوية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لتتبع التغيرات المحلية طوليا في ECM صلابة في نماذج ورم 3D. ونحن نتصور أن هذه المنهجية يمكن أن تعتمدها علماء الأحياء السرطان وفيزيولوجيون المهتمين في السلوك mechanosensitive المتورطين في مصفوفة إعادة عرض خلال...

يبدو واضحا من مجموعة متزايدة من الأدلة في الأدب أن الخلايا السرطانية، كما هو الحال مع الخلايا الظهارية الثديية غير الخبيثة، هي حساسة للغاية إلى الخواص الميكانيكية والفيزيائية الحيوية المحيطة بها المصفوفة خارج الخلية (ECM) ومكونات أخرى المكروية 1-9. وقد وفرت الدراسات الآلية أنيقة نظرة ثاقبة لدور صلابة خارج الخلية كشريك إشارات mechanosensitive المعقدة التي تنظم السلوك نمو خبيث والتشكل 2،3،10،11. وقد تيسر هذا العمل ولا سيما من خلال تطوير نماذج 3D في المختبر أن الورم استعادة بيولوجيا هندسة الأنسجة ذات الصلة، ويمكن زراعتها في المواد السقالة مع الميكانيكا الانضباطي والتقط بواسطة المجهر الضوئي 12-19. ومع ذلك، فإن الجانب الآخر من هذا الحوار mechanoregulatory بين الورم والمكروية، وسرطان الخلايا بدوره من خلالها تعديل الريولوجيا من محيطهم، لا يزال إلى حد ماأكثر صعوبة للدراسة. على سبيل المثال، أثناء عمليات الغزو، والخلايا في محيط الورم قد يخضع الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) وزيادة التعبير عن metalloproteases مصفوفة (تقوم ال MMPs) التي تسبب تدهور المحلية من ECM 20-22، والذي بدوره يؤثر على سلوك نمو mechanosensitive من الخلايا السرطانية القريبة الأخرى. من خلال مجموعة متنوعة من العمليات البيوكيميائية، وسرطان الخلايا الهاتفي باستمرار صلابة بيئتهم المحلية صعودا وهبوطا لتناسب عمليات مختلفة في أوقات مختلفة. والدافع وراء هذه المنهجية الموصوفة هنا بسبب الحاجة إلى الأدوات التحليلية التي تبلغ عن التغيرات المحلية في صلابة والامتثال للECM خلال النمو، والتي يمكن دمجها مع نماذج 3D والورم المترابطة طوليا مع التغيرات البيوكيميائية والمظهرية دون إنهاء ثقافة. في البحث عن الطريقة الصحيحة لتنفيذ في هذا السياق، microrheology الجسيمات تتبع (PTM) يظهر كمرشح قوي.هذا الأسلوب، رائدة في الأصل من قبل ميسون ويتز 23،24، يستخدم حركة تحقيقات التتبع جزءا لا يتجزأ من السوائل المعقدة للإبلاغ عن معامل معقدة تعتمد على تردد اللزجة القص، G * (ω) في جداول طول ميكرون. وقد تم تطوير هذا النهج العام مع وجود اختلافات متعددة تناسب تطبيقات مختلفة في لينة مكثف المسألة، الغرويات، الفيزياء الحيوية والفيزياء البوليمر 25-31. PTM له بعض المزايا النسبية لأساليب أخرى، حيث يتم تقديم قراءات من زوجية المحلية من خلال التصوير الفيديو غير مدمرة تحقيقات التتبع غير نشط كيميائيا التي أدرجت في وقت إعداد الثقافة وتبقى في مكانها على مدى فترات طويلة من النمو. هذا هو على النقيض من القياسات معيار الذهب مع القص متذبذبة مقياس غلفاني بكميات كبيرة، الأمر الذي يتطلب بالضرورة إنهاء ثقافة والتقارير الريولوجيا العيانية الأكبر من عينة بدلا من القياسات نقطة داخل مجمع microenvir الورم 3Donment. في الواقع عددا من الدراسات قد بينت فائدة تفسير قياسات حركات التتبع التحقيق في أو حول الخلايا السرطانية أو غير السرطانية لقياس التشوهات المرتبطة بالهجرة خلية 32، إجهاد الناجم عن كروي توسيع 33، 34،35 الريولوجيا داخل الخلايا، و لرسم خريطة الضغوط الميكانيكية وهندسة الأنسجة سلالات في 36، والعلاقة بين حجم المسام وسرعة الغزو 37. تقنيات أخرى مناسبة لmicrorheology، مثل القوة الذرية المجهري (AFM) يمكن تنفيذها، ولكن في المقام الأول لبحث نقاط على سطح العينة وأيضا قد تشكل قضايا العقم الثقافة التي تعقد قياسات الطولية 38. هنا، نحن تصف بروتوكول شامل يشمل أساليب لنمو الورم 3D الكروية مناسبة لنقل في ECM مع تحقيقات الفلورسنت المدمجة للفيديو الجسيمات تتبع وتحليل أساليب لرسم خرائط موثوق المكانيةالتغييرات في microrheology على مر الزمن في الثقافة. في تنفيذ الحاضر، تزرع نماذج 3D الورم في شكل multiwell بهدف نحو إدماج قياسات microrheology مع المقايسات التقليدية الأخرى (على سبيل المثال، السمسة) هذا الشكل الذي يفضي إلى. في هذا التوضيح ممثل هذه المنهجية أننا الثقافة في المختبر باستخدام الأجسام الشبه الكروية 3D-1 PANC الخلايا، وهو خط خلية سرطان البنكرياس أنشئت المعروفة لتشكيل الأجسام الشبه الكروية 39، ولكن جميع القياسات الموصوفة هنا تنطبق على نطاق واسع لدراسة الأورام الصلبة باستخدام مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا مناسبة لثقافة 3D. لأنه يستند أصلا إلى التصوير هذه الطريقة هي مناسبة بشكل مثالي لاشتراكهما تسجيل البيانات microrheology عالية الدقة مع الحقول التي تنتقل عن طريق الضوء كبير من الرأي القائل بأن التبليغ عن أي تغييرات في نمو الخلايا، والهجرة والنمط الظاهري. تنفيذ PTM متكاملة مع المجهر الضوئي المنقولة بهذه الطريقة يفترض تحديد المواقع استنساخه من ذوي الخوذات البيضاء مرحلة المجهرمعنوى يتوفر عادة على المجاهر البيولوجية widefield epifluorescence التجارية الآلية. بروتوكول تطوير أدناه يمكن تنفيذها مع أي المجهر البيولوجية مضان الآلي مجهزة بشكل معقول. هذا هو أسلوب كثيفة البيانات بطبيعتها، الأمر الذي يتطلب اكتساب غيغابايت من البيانات المجهري الفيديو الرقمية لمعالجة حاليا. في بروتوكول التالية، بروتوكول 1 تنتمي إلى الإعداد الأولي من الأجسام الشبه الكروية الورم الذي يوصف هنا باستخدام تراكب على الاغاروز ولكن يمكن أن تكون بديلا مع مجموعة متنوعة من وسائل أخرى مثل شنقا انخفاض بنسبة 40، 41 أو الثقافة الدوارة التقنيات. يصف بروتوكول 2 عملية التضمين الكروية في سقالة الكولاجين على الرغم بدلا من ذلك، يمكن أن تزرع في المختبر الأورام 3D بواسطة التغليف أو تضمين الخلايا معلق في ECM 12،15، بدلا من الأجسام الشبه الكروية غير ملتصقة واحدة شكلت من قبل. البروتوكولات اللاحقة تصف إجراءات سbtaining القياسات microrheology وقت حل من خلال الحصول على ومعالجة البيانات المجهري الفيديو، على التوالي. يوصف معالجة البيانات باستخدام MATLAB، والاستفادة من إجراءات مفتوحة المصدر لPTM مبنية على خوارزميات صفت في الأصل من قبل كروكر وجرير 42، والتي قد وضعت أيضا على نطاق واسع لمنصات البرمجيات المختلفة (انظر http://www.physics.emory.edu/ ~ أسابيع / IDL /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

وقد تبين المكروية الميكانيكية ليكون بمثابة منظم حاسمة للسلوك نمو الورم والإشارات، التي هي في حد ذاتها تشكيلها وتعديلها كجزء من مجموعة معقدة، والتفاعلات في اتجاهين mechanosensitive. في حين أن تطوير نماذج 3D بيولوجيا الورم ذات الصلة سهلت الدراسات الآلية على أثر مصفوفة الريولوجيا على نمو الورم، والمشكلة معكوس التغييرات رسم الخرائط في البيئة الميكانيكية الناجمة عن الأورام يظل تحديا. هنا، نحن تصف تنفيذ تتبع الجسيمات microrheology (PTM) بالتزامن مع نماذج 3D من سرطان البنكرياس كجزء من نهج قوية وقابلة للحياة لرصد التغيرات الجسدية طوليا في المكروية الورم، في الموقع. المنهجية الموصوفة هنا يدمج نظام إعداد نماذج 3D في المختبر جزءا لا يتجزأ من نموذج مصفوفة خارج الخلية (ECM) السقالة من النوع الأول الكولاجين مع تحقيقات fluorescently المسمى موزعة بشكل متجانس لحماماتsition والقياسات microrheology تعتمد على الوقت في جميع أنحاء العينة. ومطلي الأورام في المختبر وبحث في ظروف موازية باستخدام لوحات التصوير multiwell. بالاعتماد على الأساليب المتبعة، يتم تحويل أشرطة الفيديو من الحركات التحقيق التتبع عبر علاقة المعمم ستوكس اينشتاين (GSER) تقديم تقرير مجمع تعتمد على تردد معامل القص اللزجة، G (ω) *. لأن هذا النهج هو القائم على التصوير، ويتم تعيين توصيف الميكانيكية أيضا على حقول المكانية التي تنتقل عن طريق الضوء كبيرة أن يقدم تقريرا في وقت واحد تغييرات نوعية في 3D حجم الورم والنمط الظاهري. ، يتم عرض نتائج التحقق من صحة البيانات المتناقضة ممثل تظهر استجابة الميكانيكية في المناطق الفرعية المرتبطة المترجمة الناجم عن الغزو تدهور المصفوفة وكذلك نظام المعايرة. وتعرض أيضا نتائج غير مرغوب فيها من أخطاء التجريبية المشتركة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من هذه القضايا. ال 96 جيدا 3D شكل الطلاء ثقافة تنفيذها في هذا البروتوكول هو جonducive لارتباط القياسات microrheology مع المقايسات فحص العلاجية أو التصوير الجزيئي لاكتساب رؤى جديدة في تأثير العلاج أو المنبهات البيوكيميائية على المكروية الميكانيكية.

للتحقق من صحة G * (ω) القياسات على مواقع محلية داخل المجمع المكروية نموذج الورم، أجريت تجربتين التحقق من صحة الأولية. أولا، وسعى للتحقق من صحة القياسات لدينا ضد &quot;المعيار الذهبي&quot; من الجزء الأكبر متذبذبة القص rheometry. نحن على استعداد عينات مماثلة من الكولاجين مصف?...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

تتبع الجسيمات microrheology يمكن استخدامها لقياس غير المدمر والتغيرات في الخريطة مكانيا خارج الخلية مصفوفة الخواص الميكانيكية في نماذج ورم 3D.

قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

في الموقع خارطة الخواص الميكانيكية لالأغشية الحيوية التي تتبع الجسيمات Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

تحسين 2D و 3D الجلد<em&gt; في المختبر</em&gt; نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

البنكرياس المشتقة الانسجه المستمدة مصفوفة بيونك للطباعة 3D خلايا البنكرياس لادن الانسجه يبني

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

تمكن صفائف الهيدروجيل من زيادة الإنتاجية لفحص تأثيرات مكونات المصفوفة والعلاجات في نماذج الأورام 3D

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...