Name: longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00
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我们非常感谢玛丽亚Kilfoil提供（开源共享MATLAB的粒子跟踪代码<a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ），以及由约翰·C·克罗克和Eric提供的较早的IDL代码和大量的文档R.周。这项工作之所以成为可能，由国家癌症研究所（NCI / NIH），K99CA155045和R00CA155045（PI：JPC）资助。

1，培养肿瘤细胞球体<ol><li>将10mL细胞培养级水中0.1克琼脂糖，得到在1％琼脂糖溶液。 </li><li>热的琼脂糖溶液至70℃以上等分40微升的琼脂糖溶液放入井在96孔板中之前（大致14秒在一个标准的微波或通过使用加热板）。 </li><li>培养板在37℃下放置至少1小时，同时用标准技术收获细胞。 </li><li>使用血细胞计数器确定在悬浮液中细胞的浓度。 </li><li>稀释细胞悬液，以1,000个细胞/毫升，加入100微升?...

在这个协议中，我们介绍一个强大和广泛适用的策略，纵向跟踪三维肿瘤模型在流脑刚度局部变化。我们设想，这种方法可能是癌症生物学家和生物物理学家感兴趣的肿瘤的生长和侵袭过程中牵连的基质重塑机械敏感性行为被采纳。的基质降解动力学精确量化可能是特别有价值的研究基质金属蛋白酶，赖氨酰氧化酶或其他有关生化物质在三维肿瘤模型是直接链接到基质重塑的活性。除了 ​​应用...

很明显从文献中的证据，癌细胞，与非恶性哺乳动物上皮细胞，是向周围的细胞外基质（ECM）和其他微环境组分1-9的机械和生物物理特性高度敏感越来越多。优雅的机理研究提供了见解外刚度作为调控的恶性生长行为和形态2,3,10,11一个复杂的机械敏感性的信令合作伙伴的角色。这项工作提供了便利尤其是3D的在恢复生物学相关的组织架构和可以种植在支架材料具有可调力学和光学显微镜成像12-19 体外肿瘤模型的发展。然而，肿瘤和微环境，通过这些癌细胞反过来修改其周围的流变性之间的这种mechanoregulatory对话的另一侧，仍有些更难以研究。例如，在侵入过程中，细胞在肿瘤的周围可经历上皮至间质转变（EMT）和增加基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，导致ECM 20-22，这反过来又影响的机械敏感性生长行为的局部降解其他近端肿瘤细胞。通过各种生化过程，癌细胞不断地拨打他们的环境的局部刚度上下，以适应不同的过程在不同的时间。这里描述的方法是由需要该报告在生长过程中的刚性和遵守ECM的局部变化，可与三维肿瘤模型被集成并与生物化学和表型变化的纵向相关性而不终止培养分析工具的动机。 为了寻找一个合适的技术，在此背景下实施的，粒子跟踪microrheology（PTM）的出现作为一个强有力的候选人。这种方法，由梅森和韦茨23,24最初开创，使用嵌入在一个复杂的流体在微米尺度报告的频率依赖的复合粘弹性剪切模量G *（ω）示踪探头的运动。这是一般的做法已经开发出适合在软凝聚态物质，胶体，生物物理学和高分子物理25-31不同应用程序的多个变体。 PTM具有相对于其它方法的某些优点，因为本地粘弹性的读数被并入在培养制备物的时间和保持在原位生长过度长时间的生化无效的示踪探针的非破坏性的视频成像提供。这是相对于黄金标准测量与振荡剪切流变仪本体，这必然需要终止培养，并报告样品的体积宏观流变性而不是复杂的三维肿瘤microenvir内点测量onment。的确许多研究已经说明解释的示踪探测运动中或周围癌或非癌细胞以测量与细胞迁移32，机械应力引起的膨胀球体33，细胞内的流变34,35相关联的变形的测量的效用，并映射的机械应力和应变在工程化组织36，并且孔径和入侵速度37之间的关系。适于microrheology其他技术，例如原子力显微镜（AFM）可以被实现，但是主要用于探测点在样品表面并且还可以构成该复杂纵向测量38培养无菌的问题。 在这里，我们描述了一个全面的协议涵盖为适合传送到ECM与嵌入式荧光探针用于视频粒子跟踪和分析方法可靠地映射空间三维球体瘤生长的方法在文化随时间的变化microrheology。在本实施方式中，三维肿瘤模型是生长在多孔形式与对掺入microrheology测量与其它传统的测定法（ 例如 ，细胞毒性），其中该格式是有利的视图。在这种方法我们培养体外三维使用PANC-1细胞的球状体这代表插图，已知以形成球状体39，但本文所述的所有测量值建立的胰腺癌细胞系是广泛适用的实体瘤的利用各种细胞系，研究适合3D的文化。因为这种方法本质上是基于成像的它非常适合与大视透射光场的报告改变细胞生长，迁移和表型高分辨率microrheology数据配准。 PTM的实施与透射光显微镜集成以这种方式假定在显微镜阶段WH的重现性定位ICH通常可在机动车商业广角落射荧光生物显微镜。下面开发的协议可以与任何合理配备自动荧光生物显微镜来实现。这是一种固有的数据密集型方法，这就需要收购数字视频显微镜数据进行离线处理千兆字节。 在下面的协议，协议1涉及在此所说明利用叠加在琼脂糖，但是可以用各种其他方法，如悬滴40，或旋转式培养41技术被取代肿瘤球状体的初始准备。方案2描述了在胶原蛋白支架嵌入球体虽然可替代地， 在体外三维肿瘤可以由封装或重新悬浮的细胞包埋在细胞外基质12,15，而不是单一的预成形的非粘附球状体生长的过程。随后的协议描述为O过程通过收购和处理视频显微镜数据，分别btaining时间分辨microrheology测量。数据处理是用MATLAB，利用对PTM建立在最初由克罗克和格里尔42，这也为不同的软件平台被广泛开发的算法描述开放源代码例程（见http://www.physics.emory.edu/描述〜周/ IDL /）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

机械微环境已被证明作为肿瘤生长行为和信号传导的关键调节剂，它是本身改造和修饰的一组复杂的，双向的机械敏感性交互的一部分。虽然生物相关的3D肿瘤模型的发展，促进了对基材的流变性对肿瘤生长的影响机理研究，在诱发肿瘤的力学环境映射变化的逆问题仍然充满挑战。在这里，我们描述粒子跟踪microrheology（PTM）在与胰腺癌三维模型相结合实施工作，作为一个强大的和可行的方法为纵向监测在肿瘤微环境的物理变化， 原位部分。这里描述的方法结合制备包埋在模型细胞外基质I型胶原的（ECM）的支架体外三维模型的系统与荧光标记探针为均匀分布婆sition和时间依赖性microrheology测量整个样品的体外肿瘤被镀和使用多孔成像板探测平行的条件。借鉴成熟的方法，示踪探测移动视频是通过广义斯托克斯爱因斯坦关系（GSER）上报复杂的与频率相关的粘弹性剪切模量G *（ω）的转化。因为这种方法是基于成像，机械特性也映射到大型透射光的空间领域同时上报3D肿瘤大小和表型的质变。代表性的结果对比显示与局部浸润引起基质降解以及系统校准相关的子区域的机械响应，验证数据列。从常见的实验误差和对这些问题的故障排除不良后果也被提出。在这个协议中实现的96孔培养三维镀格式为conducive到microrheology测量与治疗筛选试验或分子成像，以获得新的见解的治疗方法或生化刺激对机械微环境影响的相关性。

为了验证G *（ω）在内的复杂模型肿瘤微环境局部位置测量的有效性，两个初始的验证实验。首先，我们试图验证我们的测量对大宗振荡剪切流变的“金标准”。我们以1.0毫克/毫升的胶原蛋白的浓度制备的胶原蛋白基质的相同的样品（无细胞）。这些样品用探针本体流变仪（TA Instruments的AR-G2，使用40毫米平行板几何形状），并通过PTM（使用相同的参数，如在本协议），将得到的G测量&#39;（?...

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

粒子跟踪microrheology可用于非破坏性的量化和空间映射的变化在三维肿瘤模型中的细胞外基质的机械性能。

细胞外基质刚性三维肿瘤模型的纵向测量用粒子跟踪Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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非接触，无标签使用拉曼光谱研究细胞和细胞外基质的监测

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

科研

生物工程

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

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Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

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在生物膜的力学性能原位制图粒子追踪Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

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提高2D和3D皮肤<em&gt;体外</em&gt;模型使用大分子拥挤

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

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