Name: longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Vi takker deling af Matlab partikel-tracking kode open source fra Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), sammen med den tidligere IDL kode og omfattende dokumentation fra John C. Crocker og Eric R. uger. Dette arbejde blev muliggjort af støtte fra National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 og R00CA155045 (PI: JPC).

1.. Dyrkning Tumor Spheroids <ol><li> Bland 10 ml cellekultur kvalitet vand med 0,1 g agarose til opnåelse af en 1% agarose-opløsning. </li><li> Heat agaroseopløsning til over 70 ° C (ca. 14 sekunder i en standard mikrobølgeovn eller ved hjælp af en varmeplade), før der afmåles 40 pi agaroseopløsning i en brønd på en 96-brønds plade. </li><li> Inkubér pladen ved 37 ° C i mindst 1 time, mens høst celler under anvendelse af standardteknikker. </li><li> Brug et hæmacytometer til bestemmelse af koncentrati...

I denne protokol introducerer vi et robust og bredt anvendelig strategi for langsgående sporing lokale ændringer i ECM stivhed i 3D tumormodeller. Vi forestiller, at denne metode vil kunne vedtages med kræft biologer og biophysicists interesseret i mekanosensitive adfærd impliceret i matrix remodellering under tumorvækst og invasion processer. Præcis kvantificering af matrix nedbrydningskinetik vil være særlig værdifuldt for dem, der studerer aktiviteten af ​​matrixmetalloproteaser, lysyloxidase eller andre...

Det fremgår af en voksende mængde af beviser i litteraturen, at kræftceller, som med ikke-maligne pattedyr epitelceller, er meget følsomme over for de mekaniske og biofysiske egenskaber af den omgivende ekstracellulære matrix (ECM) og andre microenvironment komponenter 1-9. Elegant mekanistiske undersøgelser har givet indsigt i den rolle ekstracellulære stivhed som et komplekst mekanosensitive signalering partner, der regulerer ondartet vækst adfærd og morfogenese 2,3,10,11. Dette arbejde er blevet lettet navnlig ved udviklingen af 3D i vitro tumormodeller som genopretter biologisk relevant væv arkitektur og kan dyrkes i stillads materialer med afstemmelige mekanik og filmede ved optisk mikroskopi 12-19. Men den anden side af denne mechanoregulatory dialog mellem tumor og mikromiljø, hvorigennem kræftceller gengæld ændre rheologien af ​​deres omgivelser, stadig nogetvanskeligere at studere. For eksempel under invasion processer celler i periferien af en tumor kan undergå epitelial til mesenkymale overgang (EMT), og forøge ekspression af matrix-metalloproteaser (MMP&#39;er), der forårsager lokal nedbrydning af ECM 20-22, hvilket igen påvirker mekanosensitive vækst adfærd andre proximale tumorceller. Gennem en række af biokemiske processer, cancerceller løbende ringe lokal stivhed af deres miljø op og ned for at passe til forskellige processer på forskellige tidspunkter. Den her beskrevne metode er motiveret af behovet for analytiske værktøjer, der rapporterer lokale ændringer i stivhed og overholdelse af ECM under væksten, der kan integreres med 3D tumormodeller og korrelerede langs med biokemiske og fænotypiske ændringer uden at afslutte kulturen. På jagt efter en passende teknik til at gennemføre i denne sammenhæng, partikel-sporing microrheology (PTM) fremstår som en stærk kandidat.Denne metode, pioner oprindeligt af Mason og Weitz 23,24 bruger bevægelsen af sporstof sonder indlejret i en kompleks væske at rapportere frekvensafhængige komplekse viskoelastiske forskydningsmodul, G * (ω) ved micron længdeskalaer. Denne generelle fremgangsmåde er blevet udviklet med flere variationer egnet til forskellige applikationer i bløde faststoffysik, kolloider, biofysik og polymer fysik 25-31. PTM har visse fordele i forhold til andre metoder, da udlæsninger af lokal viskoelasticitet leveres af ikke-destruktiv video billeddannelse af biokemisk inaktive tracer sonder, der er indarbejdet på tidspunktet for forberedelse kultur og forblive på plads over længere perioder vækst. Dette er i modsætning til guld standard målinger med en oscillatorisk forskydning bulk-rheometer, hvilket nødvendigvis kræver ophør af kultur og rapporter hovedparten makroskopiske rheologi prøven snarere end punktmålinger inden komplekset 3D tumor microenvirjøet. Faktisk en række undersøgelser har vist nytten af fortolkningen målinger af sporstof probe bevægelser i eller omkring cancer eller ikke-cancerceller til at måle deformationer forbundet med cellemigrering 32, mekanisk stress induceret af en ekspanderende sfæroid 33 intracellulær rheologi 34,35 og at kortlægge mekaniske belastninger i manipuleret væv 36, og forholdet mellem porestørrelse og invasion hastighed 37. Andre teknikker er egnede til microrheology, såsom atomic force mikroskopi (AFM) kan gennemføres, men primært til sondering punkter på prøvens overflade, og også kan udgøre kultur sterilitet problemer, der komplicerer langsgående målinger 38.. Her beskriver vi en omfattende protokol omfatter metoder til vækst af 3D tumor spheroids egnet til overførsel til ECM med indlejret fluorescerende prober til video partikel-sporing og analysemetoder for pålidelig kortlægning rumligeændringer i microrheology over tid i kultur. I den nuværende implementering, er 3D tumormodeller dyrket i flere brønde format med udsigt til inkorporering af microrheology målinger med andre traditionelle assays (fx cytotoksicitet), som dette format er befordrende for. I dette repræsentative illustration af denne metode vi kultur in vitro 3D sfæroider ved hjælp PANC-1-celler, en etableret bugspytkirtelkræft cellelinie kendt for at danne sfæroider 39, men alle målinger, der er beskrevet heri, er bredt anvendelige til at studere af faste tumorer ved anvendelse af en række forskellige cellelinjer egnet til 3D-kultur. Fordi denne metode er i sagens natur imaging-baserede det er velegnet til co-registrering af høj opløsning microrheology data med store transmitteret lys synsfelter, der rapporterer ændringer i cellevækst, migration og fænotype. Gennemførelsen af ​​PTM integreret med transmitteret lysmikroskopi på denne måde antager reproducerbar positionering af mikroskopbordet whICH er typisk tilgængelig på motoriserede kommerciel Widefield epifluorescens biologiske mikroskoper. Den protokol udviklet nedenfor kan implementeres med en hvilken som helst rimelighed udstyret automatiseret fluorescens biologisk mikroskop. Dette er en iboende data-intensive metode, som kræver erhvervelse af gigabytes af digitale video mikroskopi data for offline forarbejdning. I den følgende protokol, protokol 1 vedrører den indledende behandling af tumor sfæroider, som er beskrevet her ved hjælp af overlay på agarose, men kan erstattes med en række andre metoder såsom hængende dråbe 40 eller roterende kultur 41 teknikker. Protokol nr. 2 beskriver processen med at indlejre spheroids i en collagen stillads dog alternativt kunne in vitro 3D tumorer dyrkes ved indkapsling eller indlejring af resuspenderede celler i ECM 12,15, snarere end enkelte præ-dannede ikke-klæbende sphæroider. Efterfølgende protokoller beskriver procedurer for obtaining tidsopløste microrheology målinger ved at erhverve og bearbejde video mikroskopi data, hhv. Databehandling er beskrevet ved hjælp af MATLAB, gør brug af open source-rutiner for PTM bygget på algoritmer oprindeligt beskrevet af Crocker og Grier 42, som også er blevet udførligt udviklet til forskellige software-platforme (se http://www.physics.emory.edu/ ~ uger / IDL /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

Den mekaniske mikromiljø har vist sig at fungere som en afgørende regulator af tumorvækst adfærd og signaler, som selv ombygget og ændret som en del af et sæt af komplekse, to-vejs mekanosensitive interaktioner. Mens udviklingen af ​​biologisk relevante 3D tumormodeller har lettet mekanistiske undersøgelser om virkningen af ​​matrix reologi på tumorvækst, det inverse problem med kortlægning ændringer i det mekaniske miljø induceret af tumorer er stadig udfordrende. Her beskriver vi implementeringen af partikel-tracking microrheology (PTM), sammenholdt med 3D-modeller af kræft i bugspytkirtlen som en del af en robust og levedygtig metode til længderetningen overvåge fysiske ændringer i tumor mikromiljø, in situ. Den her beskrevne metode integrerer et system forberede in vitro 3D-modeller indlejret i en model ekstracellulære matrix (ECM) stillads af type I kollagen med fluorescens-mærkede prober jævnt fordelt til position-og tidsafhængige microrheology målingerne i hele prøven. In vitro tumorer forgyldt og undersøgt i parallelle forhold ved hjælp multibrønds imaging plader. Tegning på etablerede metoder, er videoer af tracer probe bevægelser forvandlet via den generelle Stokes Einstein Relation (GSER) for at rapportere det komplekse frekvensafhængig viskoelastiske forskydningsmodul, G * (ω). Fordi denne tilgang er imaging-baseret, er mekanisk karakterisering også kortlagt på store transmitteret lys rumlige felter samtidig rapportere kvalitative ændringer i 3D tumor størrelse og fænotype. Repræsentative resultater, der viser kontrasterende mekanisk reaktion i delregioner forbundet med lokaliseret invasion-induceret matrixnedbrydning samt system kalibrering, er datavalidering præsenteres. Uønskede resultater fra almindelige eksperimentelle fejl og fejlfinding af disse spørgsmål er også præsenteret. 96-brønds 3D kultur plating format implementeret i denne protokol er conducive til korrelation af microrheology målinger med terapeutiske screeningassays eller molekylær billeddannelse til at få ny indsigt i virkningen af ​​behandlinger eller biokemiske stimuli på den mekaniske mikromiljø.

For at verificere gyldigheden af G * (ω) målinger på lokaliserede positioner inden en kompleks model tumor mikromiljø, blev to indledende validering eksperimenter udført. Først, vi forsøgt at validere vores målinger mod &quot;gold standard&quot; af bulk oscillerende shear rheometry. Vi forberedt identiske prøver af collagenmatrix (uden celler) ved en koncentration på 1,0 mg / ml collagen. Disse prøver blev undersøgt med en bulk rheometer (TA Instruments AR-G2, ved hjælp af 40 mm parallel plade geom...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Partikel-tracking microrheology kan anvendes til ikke-destruktivt kvantificere og rumlig kortlægning af ændringer i ekstracellulær matrix mekaniske egenskaber i 3D tumormodeller.

Longitudinal Måling af ekstracellulær matrix Stivhed i 3D tumormodeller med Partikel-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri overvågning af celler og ekstracellulær matrix ved hjælp af Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Kortlægning af de mekaniske egenskaber af biofilm fra Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Forbedring 2D og 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modeller Brug Macromolecular Fortrængning

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogeler fra Pulmonal ekstracellulære matrix for 3D cellekultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

En protokol til Real-time 3D enkelt partikel Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Opdigte en nyre Cortex ekstracellulære Matrix-afledte Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pancreasvæv-afledte ekstracellulære matrix Bioink til udskrivning 3D celle-lastet pancreas væv konstruktioner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

En menneskelig 3D ekstracellulær matrix-Adipocyte kultur model for at studere matrix-celle metaboliske Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Hydrogelarrays muliggør øget gennemstrømning til screeningseffekter af matrixkomponenter og terapi i 3D-tumormodeller

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...