Name: longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00
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Nous tenons à remercier le partage open-source d&#39;un code de traces de particules MATLAB fournies par Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), avec le code précédent IDL et une documentation détaillée fournie par John C. Crocker et Eric Semaines R.. Ce travail a été rendu possible grâce au financement de l&#39;Institut national du cancer (NCI / NIH), K99CA155045 et R00CA155045 (PI: CPM).

1. Sphéroïdes La culture de la tumeur <ol><li> Mélanger 10 ml de l&#39;eau de qualité culture cellulaire avec 0,1 g d&#39;agarose pour obtenir une solution d&#39;agarose à 1%. </li><li> solution d&#39;agarose à la chaleur au-dessus de 70 ° C (plus ou moins 14 secondes dans un four micro-ondes standard ou à l&#39;aide d&#39;une plaque chauffante) avant aliquotage 40 ul de solution d&#39;agarose dans un puits d&#39;une plaque à 96 puits. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant au moins 1 heure tandis que...

Dans ce protocole, nous introduisons une stratégie robuste et largement applicable pour le suivi longitudinal des changements locaux dans ECM rigidité dans des modèles de tumeurs 3D. Nous prévoyons que cette méthode pourrait être adoptée par les biologistes du cancer et biophysiciens intéressés par le comportement mécanosensible impliquée dans le remodelage matriciel pendant la croissance de la tumeur et les processus d&#39;invasion. Quantification précise de la matrice cinétique de dégradation pourrait ê...

Il est clair à partir d&#39;un nombre croissant de preuves dans la littérature que les cellules cancéreuses, comme les cellules épithéliales de mammifères non malignes, sont très sensibles aux propriétés mécaniques et biophysiques de la matrice extracellulaire environnante (ECM) et d&#39;autres composants de microenvironnement 1-9. Études mécanistiques élégantes ont donné un aperçu du rôle de la rigidité extracellulaire en tant que partenaire de signalisation mécano complexe qui régit le comportement de la tumeur maligne et la morphogenèse 2,3,10,11. Ce travail a été facilité en particulier par le développement de la 3D dans des modèles de tumeurs in vitro qui restaurent biologiquement architecture tissulaire pertinents et peuvent être cultivées dans des matériaux d&#39;échafaudage mécanique accordables et imagés par microscopie optique 12-19. Cependant, de l&#39;autre côté de cette boîte de dialogue entre mechanoregulatory microenvironnement tumoral et, à travers laquelle les cellules cancéreuses, à son tour modifier la rhéologie de leur environnement, reste assezplus difficile à étudier. Par exemple, au cours des processus d&#39;invasion, les cellules à la périphérie d&#39;une tumeur peut subir une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et augmenter l&#39;expression de métalloprotéases matricielles (MMP) qui provoquent une dégradation locale de l&#39;ECM 20 à 22, qui à son tour, influence le comportement de croissance mécanosensible d&#39; d&#39;autres cellules tumorales proximales. Grâce à une variété de processus biochimiques, les cellules cancéreuses composer continuellement la rigidité locale de son environnement de haut en bas en fonction de différents processus à des moments différents. La méthode décrite ici est motivé par le besoin d&#39;outils d&#39;analyse qui rendent compte des changements locaux dans la rigidité et la conformité de l&#39;ECM lors de la croissance, qui peuvent être intégrés aux modèles tumoraux 3D et corrélés longitudinalement par des changements biochimiques et phénotypiques sans mettre fin à la culture. A la recherche d&#39;une technique appropriée pour mettre en œuvre dans ce contexte, microrhéologie particules de suivi (PTM) apparaît comme un candidat sérieux.Ce procédé, a lancé à l&#39;origine par Mason et 23,24 Weitz, utilise le mouvement de sondes de traceurs incorporés dans un fluide complexe pour signaler le module complexe dépendant de la fréquence viscoélastique de cisaillement, G * (ω) à des échelles de longueur micron. Cette approche générale a été développé avec de multiples variantes adaptées pour différentes applications dans la matière, colloïdes, biophysique molle condensée et la physique des polymères 25-31. PTM a certains avantages par rapport à d&#39;autres méthodes, comme les lectures de viscoélasticité locale sont fournies par l&#39;imagerie vidéo non destructif de sondes de traceurs biochimiques inactifs qui sont incorporés au moment de la préparation de la culture et restent en place pendant de longues périodes de croissance. Ceci est en contraste avec les mesures de l&#39;étalon-or avec un rhéomètre à cisaillement oscillatoire vrac, ce qui nécessite obligatoirement la fin de la culture et des rapports de la rhéologie macroscopique de l&#39;échantillon en vrac plutôt que des mesures ponctuelles sein de la tumeur microenvir 3D complexeronnement. En effet, un certain nombre d&#39;études ont montré l&#39;utilité de l&#39;interprétation des mesures de mouvements de la sonde de traceur dans ou autour de cellules cancéreuses ou non-cancéreuses de mesurer des déformations associées à la migration des cellules 32, le stress mécanique induit par un sphéroïde expansion 33, rhéologie intracellulaire 34,35, et mapper les contraintes mécaniques et les déformations dans les tissus par génie 36, et la relation entre la taille des pores et la vitesse d&#39;invasion 37. D&#39;autres techniques appropriées pour microrhéologie, telles que la microscopie à force atomique (AFM) peuvent être mises en œuvre, mais surtout pour les points de palpage à la surface de l&#39;échantillon et peuvent également poser des problèmes de stérilité culture qui compliquent les mesures longitudinales 38. Ici, nous décrivons un protocole complet qui englobe les méthodes de croissance des sphéroïdes tumoraux 3D appropriés pour le transfert dans ECM avec des sondes fluorescentes intégrés pour la vidéo particules de suivi et d&#39;analyse pour la cartographie fiable spatialechangements dans microrhéologie au fil du temps dans la culture. Dans la présente application, les modèles de tumeurs 3D sont cultivées en format multi-puits en vue de leur incorporation des mesures de Microrhéologie avec d&#39;autres tests traditionnels (par exemple, cytotoxicité) qui ce format est propice à la. Dans cette illustration représentative de cette méthodologie nous culture in vitro sphéroïdes 3D en utilisant des cellules Panc-1, une lignée cellulaire de cancer pancréatique établi connus pour former des sphéroïdes 39, mais toutes les mesures décrites ici sont largement applicables à l&#39;étude des tumeurs solides en utilisant une variété de lignées cellulaires adaptés à la culture 3D. Fondés sur l&#39;imagerie parce que cette méthode est intrinsèquement il est idéal pour les co-enregistrement des données de Microrhéologie haute résolution avec de grands champs de diascopie de vue qui signalent des changements dans la croissance cellulaire, la migration et le phénotype. La mise en œuvre de PTM intégré à la microscopie lumière transmise de cette manière suppose positionnement reproductible des wh stade de microscopeich est généralement disponible sur grand champ épifluorescence commerciale microscopes biologiques motorisés. Le protocole développé ci-dessous peut être mis en oeuvre avec n&#39;importe quel fluorescence automatisé microscope biologique raisonnablement équipé. Il s&#39;agit d&#39;une méthode intensive de données en soi, ce qui nécessite l&#39;acquisition de gigaoctets de données numériques de microscopie vidéo pour le traitement hors ligne. Dans le protocole suivant, le protocole 1 se rapporte à la préparation initiale des sphéroïdes de tumeur qui est décrite ici en utilisant superposition sur agarose, mais pourrait être substitués par une variété d&#39;autres méthodes telles que la goutte suspendue 40, ou culture rotatif 41 techniques. Protocole 2 décrit le processus d&#39;intégration des sphéroïdes dans un échafaudage de collagène mais alternativement, in vitro tumeurs en 3D peuvent être cultivées par encapsulation ou l&#39;incorporation de cellules remises en suspension dans l&#39;ECM 12,15, plutôt que de sphéroïdes non adhérentes simples pré-formées. Protocoles suivants décrivent les procédures pour obtenir des mesures de Microrhéologie résolues en temps par l&#39;acquisition et le traitement des données de microscopie vidéo, respectivement. Le traitement des données est décrit en utilisant MATLAB, faisant usage de routines open source pour PTM construit sur ​​des algorithmes initialement décrite par Crocker et Grier 42, qui ont également été largement développés pour différentes plates-formes logicielles (voir http://www.physics.emory.edu/ ~ semaines / idl /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

Le micro-mécanique a été montré pour agir comme un régulateur essentiel du comportement de la croissance tumorale et de signalisation, qui est elle-même transformée et modifiée dans le cadre d&#39;un ensemble d&#39;interactions, dans les deux sens mécanosensibles complexes. Alors que le développement de modèles de tumeurs 3D biologiquement pertinentes ont facilité études mécanistiques sur l&#39;impact de la matrice rhéologie sur la croissance de la tumeur, le problème inverse de l&#39;évolution de la cartographie de l&#39;environnement mécanique induite par des tumeurs reste difficile. Ici, nous décrivons la mise en œuvre de microrhéologie de traces de particules (PTM) en conjonction avec des modèles 3D de cancer du pancréas dans le cadre d&#39;une approche robuste et viable pour le suivi longitudinal des changements physiques dans le microenvironnement de la tumeur, in situ. La méthodologie décrite ici intègre un système de préparation de modèles in vitro 3D incorporés dans un modèle de matrice extracellulaire (ECM) de l&#39;échafaudage de collagène de type I avec des sondes marquées par fluorescence répartis uniformément pour po-sition et des mesures de temps-dépendante Microrhéologie à travers l&#39;échantillon. tumeurs in vitro sont étalées et sondés dans des conditions parallèles en utilisant des plaques d&#39;imagerie multi-puits. S&#39;appuyant sur ​​des méthodes établies, les vidéos des traceurs mouvements de la sonde sont transformés par la Relation généralisé Stokes Einstein (TBS) pour signaler le complexe viscoélastique module de cisaillement dépendant de la fréquence, G * (ω). Parce que cette approche est basée imagerie, caractérisation mécanique est également mappé sur de grands champs spatiaux transmis-lumière de signaler simultanément des changements qualitatifs dans la taille et le phénotype tumoral 3D. Les résultats représentatifs montrant contraste réponse mécanique dans les sous-régions associées à une dégradation locale de la matrice induite invasion ainsi que le calibrage du système, les données de validation sont présentés. Résultats indésirables de erreurs expérimentales communes et le dépannage de ces questions sont également présentés. Le format de la culture placage 3D 96 puits mis en œuvre dans ce protocole est conducive de corrélation des mesures de Microrhéologie avec des essais de criblage thérapeutiques ou d&#39;imagerie moléculaire à acquérir de nouvelles connaissances dans l&#39;impact des traitements ou à des stimuli biochimiques sur le microenvironnement mécanique.

Pour vérifier la validité de G * (ω) des mesures à des positions localisées dans un micro-environnement de la tumeur modèle complexe, deux expériences de validation initiales ont été menées. Tout d&#39;abord, nous avons cherché à valider nos mesures contre le «gold standard» de masse oscillante cisaillement rhéométrie. Nous avons préparé des échantillons identiques de matrice de collagène (sans cellules) à une concentration de 1,0 mg / ml de collagène. Ces échantillons ont été sondés a...

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

microrhéologie de traces de particules peut être utilisé pour quantifier de manière non destructive et spatialement cartographier les changements dans les propriétés mécaniques matrice extracellulaire dans des modèles de tumeurs 3D.

Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

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