Name: longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00
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हम कृतज्ञता (मारिया Kilfoil द्वारा प्रदान MATLAB कण ट्रैकिंग कोड के खुले स्रोत साझा करने को स्वीकार करते हैं <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), जॉन सी. क्रोकर और एरिक द्वारा प्रदान की पहले आईडीएल कोड और व्यापक प्रलेखन के साथ आर सप्ताह. यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NCI / एनआईएच), K99CA155045 और R00CA155045 (जेपीसी पीआई) से धन द्वारा ही संभव बनाया गया था.

1. संवर्धन ट्यूमर Spheroids <ol><li> एक 1% agarose समाधान प्राप्त करने के लिए agarose के 0.1 जी के साथ सेल संस्कृति ग्रेड पानी की 10 मिलीलीटर मिलाएं. </li><li> एक 96 अच्छी तरह से थाली पर एक कुएं में agarose समाधान के 40 μl aliquoting से पहले 70 डिग्री सेल्...

इस प्रोटोकॉल में हम अनुलंबीय 3D ट्यूमर मॉडल में ईसीएम कठोरता में स्थानीय परिवर्तन पर नज़र रखने के लिए एक मजबूत और व्यापक रूप से लागू रणनीति परिचय. हम इस पद्धति को ट्यूमर के विकास और आक्रमण की प्रक्रिया क...

यह कैंसर की कोशिकाओं, गैर घातक स्तनधारी उपकला कोशिकाओं के साथ ही, आसपास के बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) और अन्य सूक्ष्म घटकों 1-9 की मैकेनिकल और biophysical गुणों को अत्यधिक संवेदनशील होते हैं कि साहित्य में सबूत के एक बढ़ती शरीर से स्पष्ट है. सुरुचिपूर्ण यंत्रवत अध्ययनों घातक वृद्धि व्यवहार और morphogenesis 2,3,10,11 को नियंत्रित करता है कि एक जटिल mechanosensitive संकेतन भागीदार के रूप में बाह्य कठोरता की भूमिका में अंतर्दृष्टि प्रदान की है. इस काम के जैविक रूप से प्रासंगिक ऊतक वास्तुकला बहाल करने और ट्यून करने योग्य यांत्रिकी के साथ पाड़ सामग्री में वृद्धि हुई है और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी 12-19 ने उतारी जा सकता है कि इन विट्रो ट्यूमर मॉडल में 3 डी के विकास के द्वारा विशेष रूप से मदद की गई है. हालांकि, ट्यूमर और बदले में कैंसर की कोशिकाओं को अपने आसपास के rheology संशोधित जिसके माध्यम से सूक्ष्म, के बीच इस mechanoregulatory संवाद के दूसरी ओर, कुछ हद तक रहता हैअध्ययन करने के लिए और अधिक कठिन. उदाहरण के लिए, आक्रमण प्रक्रिया के दौरान, एक ट्यूमर की परिधि में कोशिकाओं में बारी की mechanosensitive वृद्धि व्यवहार को प्रभावित करती है जो ईसीएम 20-22, स्थानीय गिरावट का कारण है कि mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला से गुजरना और मैट्रिक्स metalloproteases (एम एम पी) की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकता है अन्य समीपस्थ ट्यूमर कोशिकाओं. जैव रासायनिक प्रक्रियाओं की एक किस्म के माध्यम से, कैंसर की कोशिकाओं को लगातार अलग अलग समय पर विभिन्न प्रक्रियाओं के अनुरूप करने के लिए ऊपर और नीचे अपने वातावरण के स्थानीय कठोरता डायल. यहाँ वर्णित पद्धति 3D ट्यूमर मॉडलों के साथ एकीकृत और संस्कृति को समाप्त किए बिना जैव रासायनिक और प्ररूपी परिवर्तन के साथ longitudinally सहसंबद्ध किया जा सकता है कि विकास के दौरान कठोरता और ईसीएम के अनुपालन में स्थानीय परिवर्तन, रिपोर्ट है कि विश्लेषणात्मक उपकरणों के लिए जरूरत से प्रेरित है. इस संदर्भ में लागू करने के लिए एक उचित तकनीक की खोज में, कण ट्रैकिंग microrheology (PTM) एक मजबूत उम्मीदवार के रूप में उभर रहे हैं.इस विधि, मेसन और वेईत्ज़ 23,24 द्वारा मूल रूप से बीड़ा उठाया है, माइक्रोन लंबाई पैमाने पर आवृत्ति पर निर्भर जटिल viscoelastic कतरनी मापांक, जी * (ω) की रिपोर्ट के एक जटिल तरल पदार्थ में एम्बेडेड ट्रेसर जांच की गति का उपयोग करता है. यह सामान्य दृष्टिकोण नरम संघनित पदार्थ, कोलाइड, बायोफिज़िक्स और बहुलक भौतिकी 25-31 में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त कई बदलाव के साथ विकसित किया गया है. स्थानीय viscoelasticity के readouts संस्कृति तैयारी के समय में शामिल किया और विकास की विस्तारित अवधि से अधिक जगह में रहते हैं कि biochemically निष्क्रिय ट्रेसर जांच की गैर विनाशकारी वीडियो इमेजिंग द्वारा प्रदान की जाती हैं, क्योंकि PTM, अन्य तरीकों के सापेक्ष कुछ फायदे हैं. यह जरूरी संस्कृति की समाप्ति की आवश्यकता है और जटिल 3D ट्यूमर microenvir भीतर बिंदु माप के बजाय नमूना के थोक macroscopic rheology जो रिपोर्ट एक oscillatory कतरनी थोक Rheometer, साथ सोने के मानक माप के विपरीत हैonment. दरअसल अध्ययन का एक नंबर सेल प्रवास 32, एक विस्तार उपगोल 33, intracellular rheology 34,35 से प्रेरित यांत्रिक तनाव के साथ जुड़े विकृतियों को मापने के लिए या कैंसर या गैर कैंसर कोशिकाओं के आसपास ट्रेसर जांच आंदोलनों की माप की व्याख्या की उपयोगिता सचित्र, और है यांत्रिक तनाव और दबाव इंजीनियर के ऊतकों 36 में, और ध्यान में लीन होना आकार और आक्रमण गति 37 के बीच संबंध मैप करने के लिए. ऐसे परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) के रूप में microrheology के लिए उपयुक्त अन्य तकनीकों, कार्यान्वित किया जा सकता है, लेकिन मुख्य रूप से भी नमूना सतह पर अंक की जांच कर रही है और के लिए अनुदैर्ध्य माप 38 उलझा कि संस्कृति बाँझपन मुद्दों खड़ी हो सकती है. यहाँ, हम मज़बूती से स्थानिक मानचित्रण के लिए वीडियो कण ट्रैकिंग और विश्लेषण के तरीकों के लिए एम्बेडेड फ्लोरोसेंट जांच के साथ ईसीएम में स्थानांतरण के लिए उपयुक्त 3D ट्यूमर spheroids के विकास के लिए तरीकों को शामिल एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णनसंस्कृति में समय के साथ microrheology में बदल जाता है. वर्तमान कार्यान्वयन में, 3 डी ट्यूमर मॉडल इस प्रारूप के लिए अनुकूल है जो अन्य पारंपरिक assays (जैसे, cytotoxicity) के साथ microrheology माप के समावेश की दिशा में एक दृश्य के साथ multiwell प्रारूप में बड़े हो रहे हैं. PANC-1 कोशिकाओं का उपयोग इस पद्धति को हम संस्कृति में इन विट्रो 3D spheroids के इस प्रतिनिधि उदाहरण में, spheroids 39 है, लेकिन इस के साथ साथ वर्णित सभी मापन के लिए फार्म में जाना एक स्थापित अग्नाशय के कैंसर कोशिका लाइन सेल लाइनों की एक किस्म का उपयोग ठोस ट्यूमर का अध्ययन करने के लिए मोटे तौर पर लागू कर रहे हैं 3D संस्कृति के लिए उपयुक्त. इस विधि स्वाभाविक इमेजिंग आधारित है क्योंकि यह आदर्श सेल के विकास, प्रवास और phenotype में परिवर्तन है कि रिपोर्ट देखने की बड़ी प्रेषित प्रकाश क्षेत्रों के साथ उच्च संकल्प microrheology डेटा के सह पंजीकरण के लिए अनुकूल है. PTM के कार्यान्वयन खुर्दबीन मंच क की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थिति हो जाती है इस तरह से प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ एकीकृतआईसीएच मोटर चालित व्यावसायिक widefield epifluorescence जैविक सूक्ष्मदर्शी पर आम तौर पर उपलब्ध है. नीचे विकसित प्रोटोकॉल किसी भी हद सुसज्जित स्वचालित प्रतिदीप्ति जैविक खुर्दबीन के साथ लागू किया जा सकता है. इस ऑफ़लाइन प्रसंस्करण के लिए डिजिटल वीडियो माइक्रोस्कोपी डेटा के गीगाबाइट के अधिग्रहण की आवश्यकता है जो एक स्वाभाविक डेटा गहन विधि है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल, प्रोटोकॉल 1 agarose पर ओवरले का उपयोग कर यहाँ वर्णित है, लेकिन इस तरह की फांसी ड्रॉप 40, या रोटरी संस्कृति 41 तकनीकों के रूप में अन्य तरीकों की एक किस्म के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जो ट्यूमर spheroids की प्रारंभिक तैयारी से संबंधित है. प्रोटोकॉल 2 वैकल्पिक रूप से, इन विट्रो 3D ट्यूमर encapsulation या resuspended कोशिकाओं के embedding ईसीएम 12,15 में है, बजाय एक पूर्व गठित गैर पक्षपाती spheroids द्वारा विकसित किया जा सकता है, हालांकि एक कोलेजन पाड़ में spheroids एम्बेड करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है. इसके बाद प्रोटोकॉल ओ के लिए प्रक्रियाओं का वर्णनक्रमशः, वीडियो माइक्रोस्कोपी डेटा प्राप्त करने और प्रसंस्करण द्वारा समय हल microrheology माप btaining. डाटा प्रोसेसिंग (देखें http://www.physics.emory.edu/, MATLAB का उपयोग मूल रूप से भी बड़े पैमाने पर अलग सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों के लिए विकसित किया गया है जो क्रोकर और Grier 42, द्वारा वर्णित एल्गोरिदम पर बनाया गया PTM के लिए खुला स्रोत दिनचर्या का इस्तेमाल कर रही है वर्णन किया गया है ~ हफ्तों / आईडीएल /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

यांत्रिक microenvironment ही remodeled और जटिल, दो तरह mechanosensitive बातचीत का एक सेट के भाग के रूप में संशोधित किया गया है जो ट्यूमर के विकास व्यवहार और संकेतन का एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया है. जैविक प्रासंगिक 3D ट्यूमर मॉडल के विकास के ट्यूमर के विकास पर मैट्रिक्स rheology के प्रभाव पर यंत्रवत अध्ययनों में मदद की है, वहीं ट्यूमर से प्रेरित यांत्रिक वातावरण में मानचित्रण परिवर्तन की व्युत्क्रम समस्या चुनौती बनी हुई है. यहाँ, हम अनुलंबीय बगल में, ट्यूमर microenvironment में शारीरिक परिवर्तन की निगरानी के लिए एक मजबूत और व्यावहारिक दृष्टिकोण के भाग के रूप में अग्नाशय के कैंसर की 3 डी मॉडलों के साथ संयोजन के रूप में कण ट्रैकिंग microrheology (PTM) के कार्यान्वयन का वर्णन है. यहाँ वर्णित पद्धति के साथ fluorescently लेबल जांच समान रूप से पुलिस के लिए वितरित की एक मॉडल के बाह्य मैट्रिक्स मैं कोलेजन प्रकार की (ईसीएम) पाड़ में एम्बेडेड में इन विट्रो 3D मॉडल तैयार करने की एक प्रणाली को एकीकृतविपक्षी और नमूना भर में समय पर निर्भर microrheology माप. इन विट्रो ट्यूमर चढ़ाया और multiwell इमेजिंग प्लेट का उपयोग समानांतर स्थिति में जांच कर रहे हैं. स्थापित तरीकों पर आकर्षित, ट्रेसर जांच आंदोलनों की वीडियो जटिल आवृत्ति पर निर्भर viscoelastic कतरनी मापांक, जी * (ω) की रिपोर्ट के सामान्यीकृत स्टोक्स आइंस्टीन रिलेशन (GSER) के माध्यम से बदल रहे हैं. इस दृष्टिकोण इमेजिंग आधारित है, इसलिए यांत्रिक लक्षण वर्णन भी एक साथ 3 डी ट्यूमर के आकार और phenotype में गुणात्मक परिवर्तन रिपोर्ट करने के लिए बड़े प्रेषित प्रकाश स्थानिक क्षेत्रों पर मैप किया जाता है. स्थानीयकृत आक्रमण प्रेरित मैट्रिक्स गिरावट के साथ ही प्रणाली अंशांकन के साथ जुड़े उप क्षेत्रों में यांत्रिक प्रतिक्रिया विषम दिखा प्रतिनिधि परिणाम, सत्यापन डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं. आम प्रयोगात्मक त्रुटियों और इन मुद्दों का निवारण से अवांछनीय परिणामों को भी प्रस्तुत कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में लागू 96 अच्छी तरह से 3 डी संस्कृति चढ़ाना प्रारूप सी हैचिकित्सकीय स्क्रीनिंग assays या यांत्रिक microenvironment पर उपचार या जैव रासायनिक उत्तेजनाओं के प्रभाव में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए आणविक इमेजिंग के साथ microrheology माप के सहसंबंध को onducive.

जी * एक जटिल मॉडल ट्यूमर microenvironment भीतर स्थानीयकृत पदों पर (ω) माप की वैधता सत्यापित करने के लिए, दो प्रारंभिक मान्यता प्रयोगों का आयोजन किया गया. सबसे पहले, हम थोक oscillatory कतरनी rheometry की &quot;सोने के मानक &#39;के ?...

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

कण ट्रैकिंग microrheology गैर विध्वंस यों और स्थानिक 3 डी ट्यूमर मॉडल में बाह्य मैट्रिक्स यांत्रिक गुणों में परिवर्तन नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

कण ट्रैकिंग Microrheology 3 डी का उपयोग ट्यूमर मॉडल में बाह्य मैट्रिक्स कठोरता के अनुदैर्ध्य मापन

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

हाइड्रोगेल सरणियाँ 3 डी ट्यूमर मॉडल में मैट्रिक्स घटकों और चिकित्सीय के स्क्रीनिंग प्रभाव के लिए बढ़े हुए थ्रूपुट को सक्षम करती हैं

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...