Name: longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

We gratefully acknowledge the open-source sharing of MATLAB particle-tracking code provided by Maria Kilfoil (<a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a>), along with the earlier IDL code and extensive documentation provided by John C. Crocker and Eric R. Weeks. This work was made possible by funding from the National Cancer Institute (NCI/NIH), K99CA155045 and R00CA155045 (PI: JPC).

1。培養腫瘍球<ol><li> 1％アガロース溶液を得るために、アガロース0.1gの細胞培養グレードの水10mlを混合する。 </li><li> 96ウェルプレートにウェルにアガロース溶液40μlを小分けする前に、70℃以上（標準電子レンジでまたは加熱板を用いておよそ14秒）への熱アガロース溶液。 </li><li>標準的な技術を用いて細胞を採取しながら、少なくとも1時間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li><...

In this protocol we introduce a robust and widely applicable strategy for longitudinally tracking local changes in ECM rigidity in 3D tumor models. We envision that this methodology could be adopted by cancer biologists and biophysicists interested in mechanosensitive behavior implicated in matrix remodeling during tumor growth and invasion processes. Precise quantification of matrix degradation kinetics could be particularly valuable to those studying the activity of matrix metalloproteases, lysyl oxidase or other relev...

それは、癌細胞が、非悪性の哺乳動物の上皮細胞と同様に、周囲の細胞外マトリックス（ECM）の機械的および生物物理学的特性および他の微小環境の成分1-9に非常に敏感であることが文献において多くの証拠から明らかである。エレガントなメカニズムの研究は、悪性増殖挙動や形態形成2,3,10,11を規制する複雑な機械受容シグナル伝達パートナーのような細胞外剛性の役割への洞察を提供してきました。この研究は、生物学的に関連する組織の構造を復元し、調整可能な力学と足場材料中で増殖させ、光学顕微鏡12-19によって画像化することができるインビトロ腫瘍モデルにおける 3Dの開発によって、特に、促進された。しかし、今度は癌細胞がその周囲のレオロジーを改変を通して、腫瘍微小環境との間のこの対話mechanoregulatory、他方の側は、多少残る勉強するのがより困難。例えば、侵入プロセスの間、腫瘍の周囲の細胞は、順番にの機械受容増殖挙動に影響を与えるECM 20-22の局所的な劣化を引き起こす間葉移行（EMT）に上皮を受け、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の発現を増加させることができる他の近位の腫瘍細胞。生化学的プロセスのさまざまな、癌細胞は、継続的に異なる時間に異なるプロセスに合わせて上下にその環境の局部剛性をダイヤルします。ここに記載された方法論は、3D腫瘍モデルと統合され、文化を終了せずに生化学的および表現型の変化を縦方向に相関させることができる成長中の剛性とECMの遵守の局所的な変化を報告分析ツールの必要性が動機とされている。 これに関連して実施するための適切な技術を求めて、粒子追跡マイクロレオロジー（PTM）が有力な候補として浮上。この方法は、メイソンとワイツ23,24によって元々の先駆者、ミクロンの長さスケールでの周波数依存性複合体の粘弾性せん断弾性率G *（ω）を報告するために、複雑な流体中に埋め込 ​​まれたトレーサプローブの動きを使用しています。この一般的なアプローチは、ソフト凝縮物質、コロイド、生物物理学、高分子物理学25-31で別の用途に適した複数のバリエーションで展開してきた。局所粘弾性の読み出しを培養調製時に組み込まれ、成長の長期間にわたって定位置に残留する生化学的に不活性トレーサープローブの非破壊ビデオイメージングにより提供されているのでPTMは、他の方法に比べて特定の利点を有している。これは必ずしも文化の終了を必要とし、複雑な3D腫瘍microenvir内のポイントの測定値ではなく、サンプルのバルク巨視的レオロジーを報告する振動剪断バルクレオメーター、とゴールドスタンダードの測定とは対照的であるふりかかる。実際、多くの研究は、細胞遊走32、拡大回転楕円体33によって誘発される機械的ストレス、細胞内レオロジー34,35に関連付けられた変形を測定するために、癌または非癌細胞または周りトレーサープローブの動きの測定値を解釈するの有用性を例示している機械的応力とひずみエンジニアリング組織36内、および細孔径および浸潤速度の37との関係をマッピングする。例えば、原子間力顕微鏡（AFM）などのマイクロレオロジーのに適した他の技術は、実現することができるが、主に、試料表面の点をプロービングするための長手方向の測定値38を複雑培養無菌性の問題を引き起こすことがある。 ここでは、確実に空間をマッピングするためのビデオの粒子追跡および分析方法のために埋め込まれた蛍光プローブを用いたECMへの転送に適した3D腫瘍スフェロイドの成長のための方法を網羅する総合的なプロトコルを記述文化の中で時間をかけてマイクロレオロジーの変化。現在の実装では、3次元腫瘍モデルはこのフォーマットが助長している他の伝統的なアッセイ（ 例えば 、細胞毒性）とマイクロレオロジー測定を組み込むことを視野に、マルチウェル形式で増殖させる。この方法論のこの代表的な実例では、本明細書に記載のPANC-1細胞を用いてインビトロ 3Dスフェロイド培養 、スフェロイド39を形成することが知られている確立された膵臓癌細胞株が、すべての測定は、様々な細胞株を用いて、固形腫瘍を研究するために広範に適用可能である3D培養に適しています。この方法は、本質的に画像化ベースであるためには、理想的に細胞の増殖、移動および表現型の変化をレポートビューの大透過光のフィールドを持つ高解像度のマイクロレオロジーデータの共同登録のために適しています。このように、透過光顕微鏡と統合され、PTMの実装では、顕微鏡ステージWHの再現可能なポジショニングを前提としていICHは電動商用広視野落射蛍光生物顕微鏡に一般的に使用可能です。下の開発されたプロトコルは、いかなる合理的に装備し、自動化蛍光生物顕微鏡を用いて実施することができる。これはオフライン処理のためのデジタルビデオ顕微鏡ギガバイトのデータの取得が必要で、本質的にデータ集約型の方法である。 以下のプロトコルにおいて、プロトコル1アガロース上でオーバーレイを使用してここに記載されているが、このような懸滴40、又は41回転培養技術などの他の様々な方法で置換することができる腫瘍スフェロイドの最初の調製に関する。プロトコル2は、代替的に、 インビトロの3D腫瘍はECM 12,15で再懸濁された細胞ではなく、単一の予め形成された非接着性スフェロイドの封入又は包埋することによって成長させることができたもののコラーゲン足場でスフェロイドを埋め込 ​​む方法が記載されている。その後のプロトコルは、Oのための手順について説明それぞれ、ビデオ顕微鏡データを取得し、処理することにより、時間分解マイクロレオロジー測定をbtaining。データ処理は、もともとも広範囲に異なるソフトウェア·プラットフォーム用に開発されているクロッカーとグリア42で説明したアルゴリズムに基づいて構築さPTMのためのオープン·ソース·ルーチンを利用して、MATLABを使用して記述されている（参照http://www.physics.emory.edu/ 〜週/ IDL /）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

機械的な微小環境は、それ自体が複雑な、双方向の機械受容相互作用のセットの一部として改造および修飾された腫瘍増殖挙動およびシグナル伝達の重要な調節因子として作用することが示されている。生物学的に関連する3D腫瘍モデルの開発は、腫瘍成長に対するマトリックスレオロジーの影響に関する機構研究を促進してきたが、腫瘍によって誘発される機械的環境におけるマッピングの変更の逆問題は、依然として厳しい。ここでは、縦方向にその場で 、腫瘍微小環境内の物理的変化を監視するための堅牢かつ実行可能なアプローチの一環として、膵臓癌の3Dモデルと連携して、粒子追跡マイクロレオロジー（PTM）の実装について説明します。ここに記載した方法では、蛍光標識プローブが均一に経口投与するための分散モデル細胞外マトリックスI型コラーゲンの（ECM）足場内に埋め込 ​​まインビトロ 3Dモデルを製造するシステムを統合試料全体sitionおよび時間依存性マイクロレオロジー測定。 インビトロ腫瘍はマルチウェルイメージングプレートを用いた並列状態でプレーティングし、プローブする。確立された方法で描画、トレーサプローブの動きのビデオは複雑な周波数依存粘弾性せん断弾性率G *（ω）を報告するために一般化ストークスアインシュタインの関係（GSER）を介して変換されます。この方法は画像ベースであるため、機械的特性評価も同時に3Dの腫瘍の大きさと表現の質的変化を報告するために大規模な透過光の空間のフィールドにマッピングされます。ローカライズされた侵入に誘導されるマトリックス分解だけでなく、システムのキャリブレーションに関連するサブ地域での機械的応答を対比示す代表的な結果は、検証データを提示する。一般的な実験誤差およびこれらの問題のトラブルシューティングから望ましくない結果も提示されています。このプロトコルで実装された96ウェルの3D培養メッキ形式はc治療スクリーニングアッセイまたは機械的微小環境に対する治療的または生化学的な刺激の影響に新たな洞察を得るための分子イメージングとマイクロレオロジー測定の相関onducive。

To verify the validity of G*(&#969;) measurements at localized positions within a complex model tumor microenvironment, two initial validation experiments were conducted. First, we sought to validate our measurements against the "gold standard" of bulk oscillatory shear rheometry. We prepared identical samples of collagen matrix (without cells) at a concentration of 1.0 mg/ml collagen. These samples were probed with a bulk rheometer (TA Instruments AR-G2, using 40 mm parallel plate geometry) and by PTM (using th...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

リアルタイム 3 D 単一粒子追跡のためのプロトコル

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

腎臓皮質細胞外マトリックス由来ハイドロゲルを製造

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

ハイドロゲルアレイにより、3D腫瘍モデルにおけるマトリックス成分および治療薬の効果をスクリーニングするためのスループットの向上が可能

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...