Name: longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Vi ønsker å takke for open-source deling av MATLAB partikkel-sporingskoden levert av Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), sammen med den tidligere IDL koden og omfattende dokumentasjon fra John C. Crocker og Eric R. Weeks. Dette arbeidet ble gjort mulig med midler fra National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 og R00CA155045 (PI: JPC).

En. Culturing Tumor Spheroids <ol><li> Bland 10 ml av cellekulturkvalitet vann med 0,1 g agarose for å oppnå en 1% agarose-løsning. </li><li> Varme agarose-løsning til over 70 ° C (omtrent 14 sekunder i et standard mikrobølgeovn, eller ved hjelp av en varmeplate) før aliquoting 40 pl av agarose-løsning inn i en brønn på en 96-brønns plate. </li><li> Inkuber platen ved 37 ° C i minst 1 time mens høste celler ved bruk av standardteknikker. </li><li> Bruk en hemacytometer å bestemme konsentrasjonen av celle...

I denne protokollen introduserer vi en robust og allment gjeldende strategi for lengde sporing lokale endringer i ECM stivhet i 3D tumor modeller. Vi ser for oss at denne metoden kunne bli adoptert av kreft biologer og Biophysicists interesserte i mechanosensitive atferd innblandet i matrise ombygging i løpet av tumorvekst og invasjons prosesser. Presis kvantifisering av matriksdegradering kinetikk kan være spesielt verdifull for de som studerer aktiviteten til matrise metalloproteaser, lysyl oksidase eller andre rele...

Det er klart fra en økende mengde bevis i litteraturen som kreftceller, som med ikke-maligne pattedyr epitelceller, er svært følsomme for mekaniske og biofysiske egenskaper i den omliggende ekstracellulære matriks (ECM) og andre mikromiljøet komponenter 1-9. Elegant mekanistiske studier har gitt innsikt i rollen som ekstracellulært stivhet som en kompleks mechanosensitive signale partner som regulerer ondartet vekst atferd og morphogenesis 2,3,10,11. Dette arbeidet har blitt tilrettelagt spesielt av utviklingen av 3D i vitro tumormodeller som gjenoppretter biologisk relevant vevsarkitektur og kan dyrkes i stillasmateriell med tunbare mekanikk og fotografert av optisk mikros 12-19. Imidlertid, er den andre side av denne mechanoregulatory dialog mellom tumor og mikromiljø, der cancercellene i sin tur modifisere reologien av sine omgivelser, er fortsatt noevanskeligere å studere. For eksempel under invasjonsprosesser, kan celler i periferien av en tumor gjennomgå epiteliale til mesenchymale overgang (EMT) og øke ekspresjonen av matriks-metalloproteaser (MMP) som forårsaker lokal nedbrytning av ECM 20-22, som i sin tur påvirker mechanosensitive vekst oppførselen andre proksimale kreftceller. Gjennom en rekke biokjemiske prosesser, kreftceller kontinuerlig ringe den lokale stivhet av deres miljø opp og ned for å passe til ulike prosesser til forskjellige tider. Metodikken er beskrevet her er motivert av behovet for analytiske verktøy som rapporterer lokale endringer i stivhet og etterlevelse av ECM under vekst, som kan integreres med 3D tumormodeller og korrelerte lengde med biokjemiske og fenotypiske endringer uten å avslutte kultur. På jakt etter en passende teknikk for å implementere i denne sammenheng, partikkel-sporing microrheology (PTM) fremstår som en sterk kandidat.Denne metode, utviklet opprinnelig av Mason og Weitz 23,24, anvender bevegelsen til tracer-prober innebygd i et komplekst fluid for å rapportere den frekvensavhengige komplekse viskoelastisk skjærmodul, G * (ω) ved micron lengdeskala. Denne generelle tilnærmingen er utviklet med flere varianter som passer for ulike anvendelser i myke kondensert materie, kolloider, biofysikk og polymerfysikk 25-31. PTM har visse fordeler i forhold til andre fremgangsmåter, da avlesninger av lokal viskoelastisitet er gitt ved ikke-destruktiv videoavbildning av biokjemisk inaktive tracer-prober som er innlemmet ved forberedelse kultur og forbli på plass over en lengre periode vekst. Dette er i motsetning til gull standard målinger med en oscillerende skjær bulk rheometer, som nødvendigvis krever avslutning av kulturen og rapporterer bulk makroskopisk reologi av prøven i stedet for punktmålinger innenfor komplekset 3D tumor microenvirtes inn. Faktisk en rekke studier har vist nytten av å tolke målingene av tracer probe bevegelser i eller rundt kreft eller ikke-cancerceller for å måle deformasjoner i forbindelse med cellemigrering 32, mekanisk stress indusert av en ekspanderende sfæroide 33, intracellulær reologi 34,35, og å kartlegge mekaniske påkjenninger og belastninger i konstruerte vev 36, og forholdet mellom pore størrelse og invasjon hastighet 37. Andre teknikker som passer for microrheology, slik som atomic force mikroskopi (AFM) kan bli gjennomført, men først og fremst for sondering poeng på prøven overflaten og kan også utgjøre kultur sterilitet problemer som vanskeliglangsgående målinger 38. Her beskriver vi en omfattende protokoll som omfatter metoder for vekst av 3D tumor sfæroider egnet for overføring til ECM med innebygde fluorescerende prober for video partikkel-sporing og analysemetoder for pålitelig kartlegge romligendringer i microrheology over tid i kultur. I den foreliggende implementeringen, er 3D tumormodeller vokst i multiwell format med tanke på inkorporering av microrheology målinger med andre tradisjonelle analyser (f.eks cytotoksisitetstester) som dette formatet er som bidrar til. I denne representativ illustrasjon av denne metoden vi-kultur in vitro 3D sfæroider ved hjelp PANC-1-celler, en etablert bukspyttkjertelkreft cellelinje kjent for å danne sfæroider 39, men alle målinger som her er beskrevet er stort sett anvendelig for å studere av faste tumorer ved hjelp av en rekke cellelinjer passende for 3D-kultur. Fordi denne metoden er iboende bildebehandling basert det er ideell for co-registrering av høyoppløselige microrheology data med store overføres lys synsfelt som rapporterer endringer i cellevekst, migrasjon og fenotype. Gjennomføringen av PTM integrert med gjennomfallende lys mikroskopi på denne måte går ut reproduserbar plassering av objektbordet which er vanligvis tilgjengelig på motoriserte kommersielle widefield epifluorescence biologiske mikroskoper. Protokollen utviklet nedenfor kan implementeres med noen rimelig utstyrt automatisert fluorescens biologisk mikroskop. Dette er en iboende data-intensive metoden, som krever kjøp av gigabyte med digitale videomikroskopi data for offline behandling. I den følgende protokoll, protokoll 1 vedrører den innledende fremstilling av tumor sfæroider som er beskrevet her, ved hjelp av overlagring på agarose, men kan være substituerte med en rekke andre fremgangsmåter som for eksempel hengende dråpe 40, eller roterende kultur 41 teknikker. Protokoll 2 beskriver prosessen med å bygge inn sfæroider i en kollagen stillaset men alternativt kan in vitro 3D tumorer dyrkes ved innkapsling eller innstøping av resuspenderte celler i ECM 12,15, i stedet for enkelt-pre-formet ikke-heftende sfæroider. Påfølgende protokoller beskriver prosedyrer for obtaining tid-løst microrheology målinger ved å hente og sette videomikroskopi data, henholdsvis. Databehandling er beskrevet ved hjelp av MATLAB, noe som gjør bruk av åpen kildekode rutiner for PTM bygget på algoritmer opprinnelig beskrevet av Crocker og Grier 42, som har også blitt grundig utviklet for ulike programvareplattformer (se http://www.physics.emory.edu/ ~ uker / IDL /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

Den mekaniske mikromiljøet har vist seg å fungere som en viktig regulator av tumorvekst oppførsel og signalering, som selv er ombygd og modifisert som en del av et sett av sammensatte, to-veis mechanosensitive interaksjoner. Mens utviklingen av biologisk relevante 3D-tumormodeller har mulig mekanistiske undersøkelser av virkningen av matrisen reologi på tumorvekst, forblir det inverse problemet med kartleggings endringer i den mekaniske miljø indusert av tumorer utfordrende. Her beskriver vi gjennomføring av partikkel-sporing microrheology (PTM) i kombinasjon med 3D-modeller av kreft i bukspyttkjertelen som en del av en robust og levedyktig metode for i lengderetningen å overvåke fysiske endringer i tumormikromiljøet, in situ. Metodikken er beskrevet her integrerer et system for å forberede in vitro 3D-modeller innebygd i en modell ekstracellulære matrix (ECM) stillaset av type I kollagen med fluorescensmerkede prober jevnt fordelt for posisjon-og tidsavhengige microrheology målinger gjennom hele prøven. In vitro svulster er belagt og analysert i parallelle forhold ved hjelp av multibrønnbildeplater. Tegning på etablerte metoder, er videoer av tracer probe bevegelser forvandlet via Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) å rapportere komplekse frekvensavhengig viskoelastisk skjærmodul, G * (ω). Fordi denne tilnærmingen er bildebasert, er mekanisk karakterisering også kartlagt på store overføres lys romlige felt å samtidig rapportere kvalitative endringer i 3D tumorstørrelse og fenotype. Representative resultater som viser kontrast mekanisk reaksjon i under regioner forbundet med lokaliserte invasjon-indusert matriksdegradering samt systemkalibrering, er validerings data presenteres. Uønskede resultater fra vanlige eksperimentelle feil og feilsøking av disse spørsmålene blir også presentert. Den 96-brønn 3D kultur plating format implementert i denne protokollen er conducive til korrelasjon av microrheology målinger med terapeutiske screening-analyser eller molekylær avbildning å få ny innsikt i effekten av behandlinger eller biokjemiske stimuli på den mekaniske mikromiljøet.

For å verifisere gyldigheten av G * (ω) målinger ved lokaliserte stillinger innenfor en kompleks modell svulst mikromiljøet, ble det gjennomført to innledende valideringsforsøk. Først forsøkte vi å validere våre målinger mot &quot;gullstandarden&quot; av bulk oscillasjon rheometry. Vi har fremstilt identiske prøver av kollagen matriks (uten celler) ved en konsentrasjon på 1,0 mg / ml kollagen. Disse prøver ble analysert med en bulk rheometer (TA Instruments AR-G2, ved bruk av 40 mm parallell plate...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Partikkel-sporing microrheology kan brukes til ikke-destruktiv kvantifisere og romlig kartlegge endringer i ekstracellulære matriks-mekaniske egenskaper i 3D-tumor modeller.

Langsgående Måling av ekstracellulære matrix Stivhet i 3D tumormodeller Bruke Partikkel-sporing Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Kartlegging av de mekaniske egenskapene til Biofilm av Partikkel-sporing Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Forbedre 2D- og 3D-Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modeller Bruke makromolekylær gruppering

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Fleksibel Hydrogeler fra Lunge ekstracellulær matriks for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

En protokoll for sanntids 3D enkelt partikkel sporing

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Fabrikere en nyre Cortex ekstracellulær Matrix-avledet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Bukspyttkjertelen tissue-avledet ekstracellulære Matrix Bioink for utskrift 3D Cell-Laden bukspyttkjertelen vev konstruksjoner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A Human 3D ekstracellulære Matrix-Adipocyte kultur modell for å studere Matrix-Cell metabolsk crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Hydrogel arrayer muliggjør økt gjennomstrømning for screeningeffekter av matrisekomponenter og terapeutiske stoffer i 3D tumormodeller

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...