Name: longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Мы выражаем глубокую признательность обмена с открытым исходным кодом от MATLAB частиц отслеживания код, предоставляемый Мария Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), наряду с ранее кода IDL и обширной документации, представленной John C. Крокер и Эрика Р. недель. Эта работа стала возможной благодаря финансовой поддержке Национального института рака (NCI / NIH), K99CA155045 и R00CA155045 (PI: СКП).

1. Культивирование Опухолевые Сфероиды <ol><li> Смешайте 10 мл сорта культуры клеток воды с 0,1 г агарозы, чтобы получить 1%-ный раствор агарозы. </li><li> Тепло раствор агарозы в свыше 70 ° С (примерно 14 сек в стандартном микроволновой печи или с помощью нагревательной плитке) до аликвоты 40 мкл раст...

В этом протоколе введем надежную и широко применимый стратегию продольно отслеживания локальные изменения в ECM жесткости в моделях 3D опухолей. Мы предполагаем, что эта методология может быть принят рака биологов и биофизиков, заинтересованных в механочувствительных поведения, причас...

Как видно из растущего организма доказательств в литературе, что раковые клетки, как и доброкачественных эпителиальных клетках млекопитающих, очень чувствительны к механическим и биофизических свойств окружающей внеклеточного матрикса (ECM) и других компонентов микроокружения 1-9. Элегантные механистические исследования предоставили понимание роли внеклеточной жесткости как сложной механочувствительных партнера сигнализации, которая регулирует злокачественную поведение роста и морфогенеза 2,3,10,11. Эта работа была облегчена, в частности, развития 3D в пробирке опухолевых моделях, которые восстанавливают биологически соответствующую архитектуру ткани и могут быть выращены в каркасных материалов с перестраиваемой механики и отображаемого с помощью оптической микроскопии 12-19. Однако, с другой стороны этого mechanoregulatory диалога между опухолью и микросреды, через который раковые клетки в свою очередь изменяет реологические свойства их окружения, остается несколькотруднее учиться. Например, во время нашествия процессов, клетки на периферии опухоли могут претерпевать эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT) и увеличения экспрессии матриксных металлопротеаз (ММР), которые вызывают местный деградацию внеклеточного матрикса 20-22, который, в свою очередь, влияет на поведение механочувствительных роста другие проксимальных опухолевые клетки. С помощью различных биохимических процессов, раковые клетки непрерывно набрать местную жесткость окружающей их среды вверх и вниз в соответствии с различными процессами в разное время. Описываемая здесь методология мотивируется необходимостью аналитических инструментов, которые сообщают местные изменения в жесткости и соответствия ЕСМ в процессе роста, которые могут быть интегрированы с 3D моделей опухоли и коррелирует продольно биохимических и фенотипических изменений, не выключая культуру. В поисках подходящей техники для реализации в этом контексте, частица отслеживания микрореология (PTM) выступает как сильного кандидата.Этот метод, впервые первоначально Мейсон и Вайц 23,24, использует движение трассирующих зондов, встроенных в комплексной жидкости сообщить комплексный модуль частотно-зависимого сдвига вязкоупругая, G * (ω) при длине микронных масштабах. Этот общий подход был разработан с несколькими вариациями подходят для различных применений в мягких конденсированных сред, коллоидов, биофизики и физики полимеров 25-31. PTM имеет определенные преимущества по сравнению с другими методами, так как показания местного вязкоупругости предоставляются неразрушающего видео визуализации биохимически неактивных меченых зондов, которые включены в момент подготовки культуры и оставаться на месте в течение продолжительных периодов роста. Это в отличие от золота стандартных измерений с колебательной сдвига объемной реометре, который обязательно требует прекращения культуры и сообщает объемную макроскопического реологические свойства образца, а не точечных измерений в рамках комплексной 3D опухоли microenvirютере. Действительно ряд исследований показано полезность интерпретации измерения движений трассирующими зонда в или вокруг раковых или не раковых клеток для измерения деформации, связанные с клеточной миграции 32, механическим нагрузкам, вызванной расширяющейся сфероида 33, внутриклеточного реологии 34,35, и для сопоставления механических напряжений и деформаций в инженерных тканей 36 и соотношение между размером пор и скорости вторжения 37. Другие методы, подходящие для микрореологические, такие как атомно-силовой микроскопии (АСМ) может быть реализован, но, прежде всего, для зондирования точки на поверхности образца, а также может представлять проблемы стерильности культуры, которые усложняют продольные измерений 38. Здесь мы описываем комплексный протокол, охватывающий методы для роста 3D опухолевых сфероидов, пригодных для передачи в ECM со встроенными флуоресцентных зондов для видео частиц отслеживания и анализа методов надежно отображения пространственныеизменения в микрореологические с течением времени в культуре. В текущей реализации, модели 3D опухолевые выращивают в многоямного формате с целью к включению измерений микрореология с другими традиционными анализами (например, цитотоксичность), которые этот формат способствует. В этом представительного иллюстрации данной методики мы, в культуре пробирке 3D сфероидов с использованием PANC-1 клетки, установлено, линия поджелудочной железы раковые клетки, как известно, образуют сфероидов 39, но все измерения, описанные здесь, могут широко применяться для изучения солидных опухолей с использованием различных клеточных линий подходит для 3D культуры. Поскольку этот метод по своей сути визуализации на основе он идеально подходит для совместного регистрации микрореология данных высокого разрешения с большими передается-световых полей зрения, которые сообщают изменения в клеточного роста, миграции и фенотипа. Осуществление PTM интегрирована с передаваемой световой микроскопии таким образом предполагает, воспроизводимое позиционирование микроскопа стадии Whич как правило, доступны на моторизованных коммерческий Widefield эпифлуоресцентной биологических микроскопов. Протокол, разработанный ниже, могут быть реализованы с любым разумно оборудованный автоматизированный флуоресценции биологического микроскопа. Само собой, это данные с интенсивным методом, который требует получения гигабайт цифровых данных видео микроскопии для автономной обработки. В следующем протоколе Протокол 1 относится к первоначальной подготовки опухолевых сфероидов, который описанных здесь с помощью наложения на агарозе но могут быть замещены различными другими способами, такими как висит капли 40 или 41 поворотного культуры методов. Протокол 2 описывает процесс встраивания сфероидов в коллагеновой строительные леса, хотя в качестве альтернативы, в пробирке 3D опухоли могут быть выращены инкапсуляции или вложения ресуспендировали клеток в ECM 12,15, а не отдельных предварительно сформированных неадгезивных сфероидов. Последующие протоколы описывают процедуры для Øbtaining временным разрешением измерения микрореология путем приобретения и обработки данных видео микроскопии, соответственно. Обработка данных описывается с помощью MATLAB, используя процедуры с открытым исходным кодом для PTM построен на алгоритмах первоначально описанных Крокер и Грира 42, который также широко развитой для различных программных платформ (см. http://www.physics.emory.edu/ ~ недели / IDL /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

Механический микросреда как было показано, действовать в качестве важнейшего регулятора поведения роста опухоли и сигнализации, которая сама отремонтирован и модифицированной в рамках набора сложных, двусторонняя механочувствительных взаимодействий. В то время как развитие биологически-соответствующих 3D моделей опухолевых способствовали механистические исследования о влиянии матрицы реологических на рост опухоли, обратная задача изменения отображения в механической среде, вызванной опухолями остается сложной. Здесь мы описываем реализацию частиц отслеживания микрореологические (PTM) в сочетании с 3D моделями рака поджелудочной железы в рамках надежной и жизнеспособной подхода для продольно мониторинга физические изменения в опухоли микроокружения, на месте. Описываемая здесь методология интегрирует систему подготовки в пробирке 3D модели, внедренные в модели внеклеточного матрикса (ECM) лесов из типа I коллагена с флуоресцентной меченые зонды, равномерно распределенное для роsition-и нестационарные измерения микрореология всей образца. опухоли в искусственных условиях высевают и исследовали в параллельных условиях с использованием многоямного рентгенографические пластины. Опираясь на установленных методов, видео трассирующих движений зонда превращаются через отношение Обобщенная Стокса Эйнштейна (GSER) представить сложную частотно-зависимого модуля сдвига вязкоупругая, G * (ω). Потому что такой подход является визуализация на основе механической характеристики также отображается на больших передается освещенности пространственных областях одновременно сообщить качественные изменения в 3D размера опухоли и фенотипа. Представитель результаты, показывающие контрастные механическую ответ в субрегионов, связанных с локализованным вторжения вызванной деградации матрицы, а также калибровки системы, данные по валидации представлены. Нежелательные результаты от общих экспериментальных ошибок и устранения неисправностей этих вопросов также представлены. 96-а 3D формате культура покрытие реализованы в этом протоколе есть сonducive соотношению измерений микрореология с терапевтическими скрининга или молекулярной визуализации, чтобы получить новое понимание влияния лечения или биохимических раздражителей на механической микросреды.

Чтобы убедиться в справедливости G * (ω) измерений в локализованных должности в сложной опухоли модель микросреды, были проведены два начальных проверочные эксперименты. Во-первых, мы стремились утвердить наши измерения против &quot;золотого стандарта&quot; объемной колебательной рео?...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Микрореология частиц отслеживания может быть использован для неразрушающего количественного и пространственно карту изменений в внеклеточного матрикса механических свойств в 3D моделей опухолей.

Продольная Измерение внеклеточного матрикса жесткости в 3D Опухолевые модели с помощью частиц отслеживания микрореология

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Бесконтактная, этикетки без мониторинга клеток и внеклеточного матрикса использованием спектроскопии комбинационного

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Жесткость на изгиб измерений биополимеров Использование Gliding Анализы

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

В Ситу отображение механических свойств биопленок частицей отслеживания микрореология

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Улучшение 2D и 3D кожи<em&gt; In Vitro</em&gt; Модели Использование макромолекулярных Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Настраиваемый гидрогели от легочного внеклеточной матрицы для 3D клеточных культур

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Протокол для слежения в реальном времени 3D одной частицы

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Изготовления внеклеточная матрица производные гидрогеля почек коры

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Поджелудочная ткань-производные внеклеточной матрицы Bioink для печати 3D-клетки-Ладена поджелудочной железы Конструкции Конструкции

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Человек 3D Экстраклеточная матрица-Адипоцит Культура Модель для изучения Матрица-Клеточная метаболический перекрестный разговор

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Гидрогелевые матрицы обеспечивают повышенную пропускную способность для скрининговых эффектов компонентов матрицы и терапии в 3D-моделях опухолей

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...