Name: longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Vi erkänner tacksamt att dela öppen källkod av MATLAB partikel-spårningskoden tillhandahålls av Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), tillsammans med den tidigare IDL-kod och omfattande dokumentation som John C. Crocker och Eric R. Weeks. Detta arbete har möjliggjorts genom finansiering från National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 och R00CA155045 (PI: JPC).

1. Odling Tumör spheroids <ol><li> Blanda 10 ml av cellodlingskvalitet vatten med 0,1 g agaros för att erhålla en 1% agaros-lösning. </li><li> Värme agaroslösningen till över 70 ° C (ungefär 14 sek i en vanlig mikrovågsugn eller genom användning av en värmeplatta) före alikvotering av 40 pl av agaroslösningen i en brunn på en 96-brunnars platta. </li><li> Inkubera plattan vid 37 ° C under minst en timme medan skörda cellerna med användning av standardtekniker. </li><li> Använd en hemacytometer för ...

I detta protokoll introducerar vi en robust och brett tillämpbar strategi för längs spåra lokala förändringar i ECM styvhet i 3D tumörmodeller. Vi ser framför oss att denna metod skulle kunna antas av cancerbiologer och biophysicists intresserade mechanosensitive uppträdande blandas in i matrix remodellering vid tumörtillväxt och invasion processer. Exakt kvantifiering av matrisnedbrytnings kinetiken kan vara särskilt värdefull för de som studerar aktiviteten av matrismetallproteaser, lysyloxidas eller and...

Det framgår av en växande mängd bevis i litteraturen att cancerceller, som med icke-maligna däggdjurs epitelceller, är mycket känsliga för de mekaniska och biofysikaliska egenskaper hos den omgivande extracellulära matrix (ECM) och andra mikrokomponenter 1-9. Elegant mekanistiska studier har gett insikter om betydelsen av extracellulärt styvhet som en komplex mechanosensitive partner signalsystem som reglerar malign tillväxt beteende och morfogenes 2,3,10,11. Detta arbete har underlättats särskilt genom utvecklingen av 3D in vitro tumörmodeller som åter biologiskt relevant vävnadsarkitektur och kan odlas i ställningsmaterial med avstämbara mekanik och avbildas genom optisk mikroskopi 12-19. Men den andra sidan av denna mechanoregulatory dialog mellan tumör och mikromiljö, varigenom cancerceller i sin tur modifiera reologin hos omgivningen, är fortfarande någotsvårare att studera. Till exempel, under invasionsprocesser får cellerna vid periferin av en tumör genomgå epitelial till mesenkymala övergång (EMT) och öka uttryck av matrix-metalloproteaser (MMP: er) som orsakar lokal nedbrytning av ECM 20 till 22, vilket i sin tur påverkar mechanosensitive tillväxtbeteende andra proximala tumörceller. Genom olika biokemiska processer, cancerceller ringa kontinuerligt den lokala styvhet sin miljö upp och ner för att passa olika processer vid olika tidpunkter. Den metod som beskrivs här motiveras av behovet av analytiska verktyg som rapporterar lokala förändringar i styvhet och efterlevnad av ECM under tillväxt, som kan integreras med 3D-tumörmodeller och korrelerade längsled med biokemiska och fenotypiska förändringar utan att avsluta kulturen. På jakt efter en lämplig teknik för att genomföra i detta sammanhang, partikel-tracking microrheology (PTM) framstår som en stark kandidat.Denna metod, pionjärer ursprungligen av Mason och Weitz 23,24, använder rörelse spår sonder inbäddade i en komplex vätska för att rapportera frekvensberoende komplex viskoelastiska skjuvmodul, G * (ω) i micron längdskalor. Denna allmänna strategi har utvecklats med flera varianter anpassade för olika tillämpningar i mjuk-kondenserad materia, kolloider, biofysik och polymerfysik 25-31. PTM har vissa fördelar i förhållande till andra metoder, eftersom avläsning av lokal viskoelasticitet tillhandahålls av icke-förstörande video avbildning av biokemiskt inaktiva spår sonder som är införlivade i samband med kultur förberedelser och förblir på plats under längre perioder av tillväxt. Detta står i kontrast till guldstandardmått med en oscillerande skjuvning bulk rheometer, som med nödvändighet kräver uppsägning av kultur och redovisar den delen makroskopisk reologi av provet istället punktmätningar inom komplexet 3D tumören microenvirjön. I själva verket ett antal studier har visat på nyttan av att tolka mätningar av spårsondrörelser i eller kring cancer eller icke-cancerceller för att mäta deformationer i samband med cellmigration 32, mekanisk stress som en expanderande spheroid 33, intracellulär reologi 34,35, och att kart mekaniska påfrestningar i iscensatte silkespapper 36, och förhållandet mellan porstorlek och invasion hastighet 37. Andra tekniker som är lämpliga för microrheology, såsom atomkraftsmikroskopi (AFM) kan genomföras, men främst för att sondera punkter på provytan och även kan innebära kultur sterilitet frågor som försvårar längsgående mått 38. Här beskriver vi ett omfattande protokoll omfattar metoder för tillväxt av 3D tumör spheroids lämpliga för överföring till ECM med inbäddade fluorescerande prober för video partikel-tracking-och analysmetoder för tillförlitligt kartlägga rumsligaförändringar i microrheology över tiden i kultur. I föreliggande implementering, är 3D-tumörmodeller vuxit i multispot-format med utsikt mot inkorporering av microrheology mätningar med andra traditionella analyser (t.ex. cytotoxicitet) som detta format bidrar till. I detta representativa exempel på denna metod vi kultur in vitro 3D spheroids använder PANC-1-celler, en etablerad pankreascancer cellinje kända för att bilda sfäroider 39, men alla mätningar som beskrivs här är brett tillämpbar för att studera av solida tumörer med hjälp av olika cellinjer lämpliga för 3D-kultur. Eftersom denna metod är till sin natur imaging-baserade den är idealisk för samtidig registrering av högupplösta microrheology uppgifter med stora genomlysnings synfält som rapporterar förändringar i celltillväxt, migration och fenotyp. Genomförandet av PTM integrerat med genomlysning mikroskopi på detta sätt antar reproducerbar placering av mikroskop scenen which är vanligtvis tillgänglig på motordrivna kommersiell widefield epifluorescence biologiska mikroskop. Protokollet utvecklades nedan kan genomföras med någon rimligen utrustade automatiserad fluorescens biologiska mikroskop. Detta är en inneboende dataintensiv metod, som kräver förvärv av gigabyte digital video mikroskopi data för offline bearbetning. I följande protokoll, protokoll 1 avser den inledande beredningen av tumör sfäroider som beskrivs här med hjälp av overlay på agaros men kan ersättas med en mängd andra metoder såsom hängande droppe 40, eller roterande kultur 41 tekniker. Protokoll 2 beskriver processen att bädda spheroids i en kollagenbyggnadsställning men alternativt kan in vitro 3D tumörer odlas genom inkapsling eller inbäddning av suspenderade celler i ECM 12,15, snarare än enstaka förformade icke-vidhäftande sfäroider. Efterföljande protokoll beskriver förfaranden för obtaining tidsupplösta microrheology mätningar genom att förvärva och behandla videomikroskopi data, respektive. Databehandling beskrivs med hjälp av MATLAB, att använda sig av öppen källkod rutiner för PTM bygger på algoritmer som ursprungligen beskrevs av Crocker och Grier 42, som har också i stor utsträckning utvecklats för olika mjukvaruplattformar (se http://www.physics.emory.edu/ ~ veckor / IDL /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

Den mekaniska mikromiljö har visat sig fungera som en viktig regulator av tumörtillväxt beteende och signalering, som själv är ombyggda och ändras som en del av en uppsättning av komplexa, tvåvägs mechanosensitive interaktioner. Medan utvecklingen av biologiskt relevanta 3D tumörmodeller har underlättat mekanistiska studier om effekterna av matris reologi på tumörtillväxt, det omvända problemet med kartläggning förändringar i den mekaniska miljön induceras av tumörer är fortsatt utmanande. Här beskriver vi genomförandet av partikel-tracking microrheology (PTM) tillsammans med 3D-modeller av cancer i bukspottskörteln som en del av en robust och livskraftig strategi för längs övervakning av fysiska förändringar i tumörens mikromiljö, in situ. Den metod som beskrivs här integrerar ett system för beredning av in vitro-3D-modeller inbäddade i en modell extracellulär matrix (ECM) byggnadsställning av typ I-kollagen med fluorescerande prober jämnt fördelade för ponings-och tidsberoende microrheology mätningar i hela provet. In vitro-tumörer är pläterade och sonderas i parallella förhållanden med hjälp av multispot avbildningsplattor. Rita på etablerade metoder, är videor av spårsondrörelser omvandlas via det allmänna Stokes Einstein Relation (GSER) att rapportera den komplexa frekvensberoende viskoelastiska skjuvmodul, G * (ω). Eftersom detta tillvägagångssätt är imaging-baserade, är mekanisk karakterisering också avbildas på stora genomlysnings rumsliga områden att samtidigt rapportera kvalitativa förändringar i 3D tumörstorlek och fenotyp. Representativa resultat som visar kontrasterande mekanisk respons i delregioner i samband med lokal invasion-inducerad matrisnedbrytning samt systemkalibrering, är valideringsdata presenteras. Oönskade resultat från vanliga experimentella fel och felsökning av dessa frågor presenteras också. Den 96-väl 3D kultur plätering format förs i detta protokoll är conducive till korrelation av microrheology mätningar med terapeutiska screeninganalyser eller molekylär avbildning för att få nya insikter i effekten av behandlingar eller biokemiska stimuli på den mekaniska mikromiljö.

För att kontrollera giltigheten av G * (ω) mätningar vid lokala positioner inom en komplex modell tumormicroenvironmenten ades två inledande validering experiment. Först sökte vi att validera våra mätningar mot den &quot;gyllene standarden&quot; för bulk oscillerande skjuvning reometri. Vi förberedde identiska prover av kollagenmatrisen (utan celler) i en koncentration av 1,0 mg / ml kollagen. Dessa prover undersöktes med en bulk reometer (TA Instruments AR-G2, med användning av 40 mm parallell plat...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Partikel-tracking microrheology kan användas för icke-destruktivt kvantifiera och rumsligt kartlägga förändringar i extracellulära matrix mekaniska egenskaper i 3D tumörmodeller.

Längsgående Mätning av extracellulär matrix Stelhet i 3D tumörmodeller Använda Partikel-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Beröringsfri, Label-free övervakning av celler och extracellulär matris med Raman-spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Böjstyvhet Mätningar av Biopolymerer Använda Gliding Analyser

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

In situ Kartläggning av de mekaniska egenskaperna hos Biofilmer av Partikel-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Förbättra 2D och 3D Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modeller Använda Macro Trängsel

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Avstämbar Hydrogeler från Lung Extracellulär Matrix för 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Ett protokoll för realtid 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Fabricera en njure Cortex extracellulära Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pankreasvävnad-härledda extracellulära matrix Bioink för utskrift 3D cell-lastat Pankreasvävnad konstruktioner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

En mänsklig 3D extracellulär matrix-Adipocyte kultur modell för att studera Matrix-cell metabola överhörning

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Hydrogel arrays möjliggör ökad genomströmning för screeningeffekter av matriskomponenter och terapier i 3D-tumörmodeller

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...