Name: the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics
Uploaded: 2013-10-21T20:30:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

Forfatterne anerkender Armenise-Harvard Foundation, Marie-Curie Trentino COFUND (ACS), den selvstyrende provins Trento (ecomm) og CIBIO til finansiering.

1.. Forberedelse af DNA-skabelon <ol><li> Oprens plasmidet fra en standard laboratorium stamme af E. coli, såsom E. coli DH5a eller Nova Blå med et kommercielt kit. Alternativt kan en lineær PCR-produkt på lignende måde renses med et kommercielt kit. Eluere DNA&#39;et med H2O kun. </li><li> Phenol-chloroform udtrække DNA-opløsningen 26. </li><li> Bestem DNA-koncentration og renhed, fx ved UV-absorbans eller andre egnede metoder. Det er vigtigt at bruge særdeles rent DNA til effektiv transkription-translation. </li></ol> 2.. Klargøring af Thin Lipid Film <ol><li> Vej den tørre lipidpulver og opløses i opløsningsmiddel. For 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC), er stamopløsninger fremstilles i chloroform ved en koncentration på 40 mg / ml. Bemærk: Organiske opløsningsmidler skal altid håndteres med glas pipetter og flasker. Med andre ord skal plast aldrig anvendes. Store sTock løsninger i lufttætte, tåler opløsningsmidler ravgule glasflasker ved -20 ° C, helst under argon. </li><li> Portion 12 pmol POPC (220 pi 40 mg / ml stamopløsning) i en 5 ml rundbundet kolbe. </li><li> Opløsningsmidlet afdampes med en rotationsinddamper (fig. 1) til at generere den tynde lipidfilm. <ol><li> Fastgør rundbundet kolbe til destillationsrøret med en cirkulær klip og starte rotation af kolben. </li><li> Indled cirkulationen af ​​vand gennem kondensatorfladen. Ved hjælp af en varme bad er ikke nødvendig, fordi chloroform har et lavt kogepunkt på 61,2 ° C ved normalt atmosfærisk tryk. </li><li> Sørg for, at systemet er åbent til atmosfæren ved at kontrollere, stophanen er åbent. Tænd vakuumpumpen og langsomt lukke stophanen at anvende vakuum til systemet. </li><li> En tynd lipidfilm er deponeret på væggene i den rundbundede kolbe under rotationsinddampning danner en uigennemsigtig filmder er synlig med det blotte øje. Lad rotationsinddampning fortsætte i 0,5-2 timer. At stoppe processen, frigiver langsomt vakuumtrykket, stoppe rotationen, og fjern rundbundet kolbe. </li></ol></li></ol> 3.. Lipid Resuspension og vesikel Homogenisering <ol><li> Tilsæt 1 ml 18.2 MOhm H2O til den tynde lipidfilm direkte i den rundbundede kolbe. Energisk vortex løsningen ved maksimal hastighed, ca 3.200 rpm, indtil Lipidfilmen frigøres fra glas, som kan observeres med det blotte øje. </li><li> Overfør lipiddispersion i en 2 ml mikrocentrifugerør. </li><li> Set-up en ring står til at holde en homogenisator med en 5 mm spids. Placer en mikrocentrifuge ligge under homogenisatoren til sikkert at holde lipiddispersion. Skyl dispergerende element homogenisatoren ved at nedsænke spidsen i 18,2 MOhm H2O og kører i et par sekunder. </li><li> Placer dispergerende element direkte i lipiddispersion sikrer thpå spidsen ikke rører bunden af ​​mikrocentrifugerør. Homogeniseres i 1 minut ved magten niveau 4 eller 14.000 rpm. </li></ol> 4.. Vesikel Ekstrudering og Lyofilisering <ol><li> Saml de dele af mini-ekstruder (figur 2), som består af et ydre hus og en låsemøtrikken der huser to Teflon indre membran understøtter, to O-ringe, og en Teflon pejling. <ol><li> Anbring de to O-ringe i rillerne på de indre membran understøtninger. Prewet to filtre og en 400 nm membran. Filtrene vil blive placeret mod Teflon indersiden af ​​O-ringe med membranen mellem dem. </li><li> Anbring membranen støtter i ekstruderen kapperøret med membranen omgivet af to filtre i mellem O-ringene. Placer Teflon lejet i kabinettet og fastgør holderen møtrikken og strammes med hånden. </li></ol></li><li> Skyl to sprøjter og fylde en med 18,2 MOhm vand. Sæt sprøjten nåle ind i den lille hOles i teflon i begge ender af ekstruderingsaggregat. Nålene skal glide i let, ikke tvinge nåle. Fastgør ekstruder med sprøjterne ind i ekstruder boliger og sy. </li><li> Passere vandet gennem ekstruderen ved langsomt at trykke vand ud af en sprøjte og ind i den anden. Dette repræsenterer en passage. Gentag for i alt tre passager sikrer, at der ikke er lækager til stede. Fjern sprøjten med vand og bortskaffe vandet. </li><li> Fyld en sprøjte med prøven, vedhæfte til ekstruderen, og langsomt passere vesikel opløsningen gennem membranen, som beskrevet ovenfor i trin 4.3. Gentag 10x for i alt 11 passager. Som ekstruderingsprocessen skrider frem, vil prøven blive mindre uklar og nemmere at skubbe over membranen. En pludselig nedgang i modstand imidlertid sædvanligvis indikerer en brud af membranen. </li><li> Overfør ekstruderede vesikel opløsning og gøre 40 gl portioner af vesikler i mikrocentrifugerør.Flash fryse hver alikvot i tøris eller i flydende nitrogen. </li><li> Lyofilisere hver alikvot med en centrifugal fordamper natten over ved 30 ° C. Opbevar de lyofiliserede tomme vesikler ved -20 ° C. </li></ol> 5.. Encapsulating Transskription-translation Machinery <ol><li> Bland komponenterne i transkription-translation reaktionen og tilsættes 20 enheder RNase-inhibitor. Inkuber på is. </li><li> Tilføj DNA-skabelonen. For en kontrol reaktion, 250 ng af et plasmid kodende mVenus eller en lignende fluorescerende protein bag en T7 transkriptionspromotor og en stærk E. coli ribosombindingsstedet anbefales. </li><li> Bring slutvolumenet til 25 pi med RNase-frit vand. </li><li> Hydrate en alikvot af lyofiliserede vesikler (fra trin 4.6) med 10 pi af reaktionen samles i trin 5.3. Kortvarigt vortex blandingen, indtil vesiklerne resuspenderes. Dette bør tage mindre end 30 sek. </li><li> Inkuber reaktionen på is i 30 min at tillade vesiklerne at svulme. </li><li> Fortynd vesikel blandingen 20 gange til et endeligt volumen på 30 ul ved tilsætning 1,5 pi vesikler i 27,0 ml 50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCl, pH 7,4 og 1,5 pi 20,2 mg / ml proteinase K. DNase og RNase kan også tilsættes på dette punkt som et alternativ til proteinase K for at nedbryde extravesicular materiale. </li><li> Inkuber i mindst 2,5 timer ved 37 ° C. </li></ol> 6.. Microscopy <ol><li> Undersøg blærer og fremskridtene med fluorescerende protein produktion på forskellige tidspunkter. Vesiklerne vil have en større diameter end 400 nm porestørrelse af membranen anvendes til vesikel ekstrudering. <ol><li> Forberede en prøve kammer ved at placere en 20 x 5 mm silicium spacer på en standard mikroskopobjektglas. Afpipetteres 10 pi af vesikler i prøvekammeret. Placer en silikoniseret dækglas over kammeret. </li><li> Observere vesikler med en 63X olie-dispersion or lignende mål ved lyse felt og fluorescens mikroskopi vha. passende filter sæt til de udbyttede fluorescerende protein. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthesis+of+a+minimal+cell.">Towards synthesis of a minimal cell.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).</li><li>Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+artificial+cell,+from+self-organization+to+computation+and+self-reproduction.">Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+Exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).</li><li>Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Proteins+through+In+Vitro+Protein+Synthesis+in+Liposomes.">Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).</li><li>Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imitations.">Cellular imitations.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).</li><li>Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+chemical+synthetic+biology.">Approaches to chemical synthetic biology.</a> FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).</li><li>Noireaux, V., Shin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).</li><li>Fujiwara, K., Nomura, S. -. i. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+an+Additive-Free+Cell+Extract+to+Mimic+the+Conditions+of+Live+Cells.">Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells.</a> PLoS ONE. 8, e54155 (2013).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Study+of+the+Structure+of+Multilamellar+Giant+Liposomes+As+a+Container+of+Protein+Synthesis+Reaction.">Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction.</a> Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).</li><li>Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protiens+Within+Liposomes.">Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes.</a> Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).</li><li>Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+liposomes+with+a+minimal+set+of+enzymes.">Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).</li><li>Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimal+Size+of+Liposome-Based+Model+Cells+Brings+about+a+Remarkably+Enhanced+Entrapment+and+Protein+Synthesis.">The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis.</a> ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Vesicle+Fusion+Triggers+Gene+Expression.">Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression.</a> Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+artificial+cell+based+on+gene+expression+in+vesicles.">Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles.</a> Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controllable+gene+expression+system+in+liposomes+that+includes+a+postive+feedback+loop.">A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop.</a> Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).</li><li>Martini, L., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-like+Systems+with+Riboswitch+Controlled+Gene+Expression.">Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression.</a> Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Association+and+Fusion+of+Giant+Vesicles+Using+a+Fluorescence-Activated+Cell+Sorter.">Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter.</a> Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Tracking+of+a+Minimum+Gene+Expression+System+Reconstituted+in+Giant+Liposomes.">Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes.</a> ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).</li><li>Lentini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+and+in+Vitro+Genetic+Organization+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth. Biol. , (2013).</li><li>Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigene+Expression+In+Vivo:+Supremacy+of+Large+Versus+Small+Terminators+for+T7+RNA+Polymerase.">Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).</li><li>Trochilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , (2003).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protein+in+Liposome.">Synthesis of Functional Protein in Liposome.</a> J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+vesicles+composed+of+monocarboxylic+or+dicarboxylic+fatty+acids+and+trimethylammonium+amphiphiles.">Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles.</a> Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).</li><li>Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+crowding+of+ribosomes+and+proteins+inside+vesicles:+a+possible+mechanism+for+the+origin+of+cell+metabolism.">Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism.</a> ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).</li><li>Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+mRNA+Measurement+during+an+in+Vitro+Transcription+and+Translation+Reaction+Using+Binary+Probes.">Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes.</a> ACS Synth. Biol. 10, (2012).</li><li>St&#246;gbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., R&#228;dler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiment+and+mathematical+modeling+of+gene+expression+dynamics+in+a+cell-free+system.">Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system.</a> Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).</li><li>Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+emergent+properties+of+a+synthetic+quasi-cellular+system.">Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system.</a> BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Large+Monodisperse+Vesicles.">Preparation of Large Monodisperse Vesicles.</a> PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Selvom celle-fri syntetisk biologi er stadig i sin vorden, har fremskridt lagt et fundament, hvorfra mere komplekse celle-lignende systemer kan foretages. Genoprettelse af transkription-translation maskiner fra fuldt defineret komponenter 9 inde i vesikler 28 var særlig markant i lette senere indsats i konstruere miljømæssigt lydhør kunstig cells17, 18 år. Ligeledes har kunstige celle undersøgelser blevet brugt til at sondere evolutionære processer 4,29,30 de mekanistiske detaljer i RNA og proteinsyntese 22,31, de påvirkninger af metabolisk load32, 33, og montering af viruspartikler 34.. Vigtigere er det, nok viden eksisterer nu, at grundlæggende cellulære funktion kan rekonstitueres inde i vesikler i laboratoriet efter disse tidligere rapporter og protokoller beskrevet heri. Ud over at være let, beskrevne indkapsling PRocedure har flere fordele. For eksempel kan mange tomme, lyofiliserede vesikel alikvoter ske på forhånd og opbevares ved -20 ° C til senere brug. Protokollen ikke underlagt biologiske molekyler til organiske opløsningsmidler, drastiske temperaturudsving, og lange perioder med dialyse. Vi forventer, at blidhed af proceduren vil lette inkorporeringen af ​​yderligere komponenter efter behov. Vi har heller ikke observeret bivirkninger til at ændre lipid sammensætning af membran på indkapsling eller transkription-translation effektivitet. Derfor kunne lipider mere modtagelig for indarbejdelse af membranproteiner, specifikke morfologier eller visualisering tænkes udnyttet. Den største begrænsning af den beskrevne fremgangsmåde er, at de resulterende vesikler ikke er homogene i størrelse eller lamellarity. Til mange anvendelser har disse vanskeligheder ikke interferere med fortolkningen af ​​data. Men hvis det er nødvendigt, kan yderligere trin inkorporeres til smal the størrelsesfordeling og mindske lag af membraner, såsom yderligere runder af ekstrudering efter indkapsling, frysetørring, eller dialyse 35.. Utvivlsomt bedre metoder, der omgår disse og andre problemer vil blive udviklet. Indtil da finder vi protokollen beskrevet her at være velegnet til opførelse af cellulære efterligner.

Celle-fri in vitro transkription-translationsreaktioner samt dannelse af vesikler fra syntetiske lipider er ikke noget nyt. Men at kombinere de to i et cellulært efterligner er betydeligt mere challenging1-6. E. coli celleekstrakter med eller uden T7-RNA-polymerase kan anvendes som en kilde af transkription-translation maskineri 7,8. Celleekstrakter fordel af tilstedeværelsen af ​​yderligere cellulære komponenter, der kan lette protein-ekspression og foldning. Alternativt, en blanding af individuelt oprensede RNA og proteinmolekyler, dvs PURE 9, kan anvendes til at mediere intravesikulær proteinsyntese 4,10-14. PURE-systemet giver mulighed for konstruktion af fuldt definerede cellulære efterligner og ikke lider af nukleaseaktivitet fundet i celleekstrakter. Praktisk betyder dette, at langt mindre DNA-skabelon er påkrævet, hvilket letter processer med lav indkapslingseffektivitet 11 </sup&gt;. Selvom mindre hyppigt anvendte, kan cellulære efterligner bygges med celleekstrakter afledt fra eukaryot cells15. Hidtil har genetisk kodet indkapslede kaskader og cellulære efterligner fornemme miljøet er blevet indberettet 16-18. Den enkleste måde at overvåge transkription-translationsreaktioner er at måle fluorescensen eller luminescens af genetisk kodede elementer. Typisk ildflueluciferase 19 eller GFP anvendes, skønt in vitro reaktioner er ofte målt ved radioaktiv mærkning. Fluorescenspåvisning desuden giver mulighed for overvågning af bestandene af vesikler 20,21 gennem cytometri baserede metoder og dermed tilbyde et indblik i den stokastiske natur af biologisk-lignende processer. Disse overvågningssystemer metoder er blevet anvendt til at definere et lille sæt af design regler og et bibliotek af dele fra at bygge fra, herunder en samling af fluorescerende proteiner, der er kompatible med in vitro transkription-translation 22, påvirkning af genetiske organisation ekspression 22, aktiviteten af sigmafaktorer 16, og effektiviteten af transkriptionelle terminatorer 23.. Alligevel er der stadig meget, der skal gøres for at øge evnen til at opbygge forudsigelig in vitro, genetisk indkodede enheder. Der er mange metoder til rådighed til at gøre vesikler. De mest almindelige metoder afhænger af dannelsen af ​​en tynd lipidfilm på en glasoverflade efterfulgt af resuspension i vandig solution24. Hvis den vandige opløsning indeholder transkription-translation maskiner, for eksempel, så en brøkdel af vesiklerne dannes ville indeholde de nødvendige komponenter til proteinproduktion. Imidlertid indkapslingseffektiviteten af ​​sådanne metoder er lav, hvilket betyder, at kun en lille procentdel af vesikler er aktive. Mange af de alternative metoder er kendetegnet ved meget højere indkapsling efficiency udnytte omdannelse af vand-i-olie-emulsion dråber til vesikler. Selv om det er sandsynligt, at sådanne metoder vil være almindeligt i fremtiden, i øjeblikket disse metoder lider behovet for specialudstyr og giver vesikler med ændrede membran kompositioner 25. En klar fordel ved vand-i-olie til vesikel metoder er potentiale for at styre membran lamellarity. Den beskrevne metode er baseret på den tynde lipidfilm protokollen beskrevet af Yomo laboratorium 11 med mindre ændringer, herunder en yderligere homogeniseringstrin. Denne metode er let, billigt og giver robuste vesikler velegnede til indkapsling af transkription-translation maskineri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

Som rente skift fra de enkelte molekyler til systemer af molekyler, har et stigende antal laboratorier forsøgt at bygge op fra bunden cellulære efterligner, der bedre repræsenterer kompleksiteten af ​​cellulære liv. Til dato er der en række stier, der kan træffes for at opbygge opdelte cellulære efterligner, herunder udnyttelse af vand-i-olie-emulsioner, mikrofluidenheder og blærer. Hver af de tilgængelige muligheder har specifikke fordele og ulemper. For eksempel giver vand i olie-emulsioner høj indkapslingseffektivitet men ikke efterligne godt permeabilitetsbarriere levende celler. Den primære fordel ved de heri beskrevne fremgangsmåder er, at de alle nemt og billigt at implementere. Transkription-translation maskineri er indkapslet inde i phospholipidvesikler gennem en proces, der udnytter fælles instrumentering, såsom en centrifugalpumpe fordamper og en ekstruder. Reaktioner overvåges af fluorescens spektroskopi. Protokollens kan tilpasses til rekombinant protein ekspression, opførelse af cellulære efterligner, udforskning af minimumskravene til cellulær liv, eller samling af genetiske kredsløb.

Fluorescensmikroskopi viser, at fluorescens kun observeret inde i vesiklerne, fordi extravesicular materiale er enzymatisk nedbrudt (figur 3). For udtryk for mVenus begynder intravesikulær fluorescens der skal hengå efter 1,5 timer ved 37 ° C og når maksimal fluorescensintensitet inden 6 timer. Den optimale temperatur og inkubationstid kan variere afhængigt af de anvendte særlige konstruktioner. For eksempel, modne forskellige fluorescerende proteiner ganske forskelligt i en temperaturafhængig måde. Med andre ord, er observationen af ​​proteinproduktion ikke udelukkende afhængig proteinsyntese og foldning men også på kromofor-dannelse. Samlet proteinsyntese kan øges ved at indarbejde membranproteinpræparater porerne til at give mulighed for en tilstrømning af forarmet nødvendige komponenter for transskription og translation 27. Det anbefales at udføre en analog transkription-oversættelsening reaktion i fravær af vesikler at sikre, at den udnyttes genetiske konstruktion er funktionel. Denne kontrol reaktion er lettere overvåges ved fluorescens spektroskopi snarere end mikroskopi. Figur 4 viser en in vitro-transskription-translationsreaktion af en konstruktion, der koder mVenus. Uindkapslet reaktioner giver meget højere samlede fluorescensintensiteter end tilsvarende intravesikulær reaktioner. Dette skyldes indkapslingseffektivitet og fordi den samlede intravesikulær volumen er meget mindre end den extravesicular volumen (dvs. en fortynding effekt). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Figur 1. Den roterende fordamper og vakuumpumpe. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> . Figur 2.. Huset og dele af ekstruder er vist særskilt. Fra venstre til højre, understøtter sprøjte, holder møtrik, teflon lejer, intern membran med sorte O-ringe står hinanden, ekstruder ydre beklædning og anden sprøjte. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . Figur 3 Fluorescens billeder af mVenus proteinproduktion i liposomer A og C:.. Lysfelt billeder af multilamellare vesikler efter 1,5 time og 2,5 timer B og &amp;# 160; D: Produktionen af mVenus visualiseres ved fluorescens (farvet grøn) efter 1,5 og 2,5 time, hhv. Målestokken er 20 um. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> . <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> Figur 4.. In vitro kontrol reaktion indkapslede in vitro transkription og translation af mVenus. Fluorescensintensitet blev målt hver 5 min i løbet af 4 timer. Dataene blev erhvervet med Real-Time PCR-instrument. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede</a> .

Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Heri beskriver vi enkle metoder til fremstilling af vesikler, indkapsling af transkription og translation maskineri, og overvågning af proteinproduktion. Den resulterende celle-fri systemer kan anvendes som udgangspunkt, hvorfra man kan bygge mere komplekse cellulære mimics.

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Beskriver en Transskription Factor Afhængig forordning af MicroRNA Transkriptomet

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Konstruktion af Modular Hydrogel Leverandørbrugsanvisning på mikromønstrede Macro-skaleret 3D Cellular Arkitektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Undertrykke gen transskription ved at omdirigere cellulære maskiner med kemiske epigenetiske modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Flash NanoPrecipitation for indkapsling af hydrofobe og hydrofile forbindelser i polymere nanopartikler

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Måling af Global cellulære Matrix Metalloproteinase og metaboliske aktivitet i 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Vurdering af opbevarings stabiliteten af ekstracellulære vesikler

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forberedelse proteinproducerende syntetiske celler ved hjælp af cellefri bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsionoverførsel

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

Indkapslingen af Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner