Name: the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics
Uploaded: 2013-10-21T20:30:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

De auteurs erkennen de Armenise-Harvard Foundation, de Marie-Curie Trentino COFUND (ACS), de autonome provincie Trento (Ecomm), en CIBIO voor financiering.

1. Voorbereiden van de DNA Template <ol><li> Zuiver plasmide uit een standaard laboratorium stam van E. coli, zoals E. coli DH5a of Nova Blue met een commerciële kit. Als alternatief kan een lineaire PCR product eveneens worden gezuiverd met een commerciële kit. Elueer het DNA met slechts H2O. </li><li> Fenol-chloroform extract van de DNA-oplossing 26. </li><li> Bepaal de DNA concentratie en zuiverheid, bijvoorbeeld door UV absorptie of andere geschikte werkwijzen. Het is belangrijk om zeer zuiver DNA gebruikt voor een efficiënte transcriptie-translatie. </li></ol> 2. Voorbereiden van de Thin Film Lipid <ol><li> Weeg de droge lipide-poeder en los op in oplosmiddel. Voor 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC) worden voorraadoplossingen bereid in chloroform bij een concentratie van 40 mg / ml. Opmerking: Organisch oplosmiddel moet altijd worden behandeld met glazen pipetten en flessen. Met andere woorden, moet plastic nooit gebruikt worden. Store stock oplossingen in luchtdichte, oplosmiddelbestendige amberkleurige glazen flessen bij -20 ° C, bij voorkeur onder argon. </li><li> Aliquot 12 umol POPC (220 gl 40 mg / ml voorraadoplossing) in een 5 ml rondbodemkolf. </li><li> Damp het oplosmiddel met een roterende verdamper (figuur 1) om de dunne lipide film genereren. <ol><li> Breng het rondbodemkolf hechten aan de destillatie buis met een cirkelvormige clip en start de rotatie van de kolf. </li><li> Inleiding van de circulatie van water door de condensor. Met behulp van een warmte bad is niet nodig, want chloroform een ​​lage kookpunt van 61,2 ° C bij normale atmosferische druk. </li><li> Ervoor zorgen dat het systeem is open voor de atmosfeer door te controleren of de kraan open is. Zet de vacuümpomp en langzaam sluit de plugkraan om het vacuüm in het systeem vast. </li><li> Een dunne lipide film wordt afgezet op de wanden van de rondbodemkolf gedurende rotatieverdamping die een ondoorzichtige filmdat zichtbaar is met het blote oog. Laat de rotatieverdamping voortgezet 0,5-2 uur. Om het proces te stoppen, langzaam los van de vacuümdruk, stop de rotatie, en verwijder de rondbodemkolf. </li></ol></li></ol> 3. Lipid Resuspensie en Vesicle Homogenisering <ol><li> Voeg 1 ml 18,2 MQ H2O de dunne lipide film direct in de rondbodemkolf. Krachtig vortex de oplossing bij maximale snelheid, ongeveer 3200 tpm, totdat de lipide film los van het glas, die waarneembaar zijn oog. </li><li> Breng de lipide dispersie in een 2 ml microcentrifugebuis. </li><li> Set-up van een ring staan ​​om een ​​homogenisator houden met een 5 mm tip. Plaats een microcentrifuge stand onder de homogenisator om veilig de lipidedispersie. Spoel het dispergeren element van de homogenisator door onderdompeling van de tip in 18,2 MQ H2O en actief gedurende enkele seconden. </li><li> Plaats het verspreiden element rechtstreeks in de lipidedispersie zorgen thaan het uiteinde is de bodem van de microcentrifugebuis niet aan. Meng gedurende 1 minuut bij vermogensniveau 4 of 14.000 rpm. </li></ol> 4. Vesicle Extrusie en Lyofilisatie <ol><li> Monteer de onderdelen van de mini-extruder (figuur 2), die bestaat uit een buitenste behuizing en een borgmoer die twee Teflon interne membraan ondersteunt twee O-ringen, en een Teflon lager herbergt. <ol><li> Plaats de twee O-ringen in de groeven van de interne membraan steunen. Prewet twee filters en een 400 nm membraan. De filters tegen teflon worden geplaatst in de O-ringen met de membraan daartussen. </li><li> Plaats het membraan ondersteunt in de extruder behuizing met membraan omringd door twee filters tussen de O-ringen. Plaats de Teflon lager in de behuizing en bevestig de borgmoer en draai deze met de hand. </li></ol></li><li> Spoel twee spuiten en vul een met 18,2 MQ water. Breng de spuit naalden in de kleine holes in de Teflon aan beide zijden van de extruder samenstel. De naalden moeten gemakkelijk ingaat, forceer de naalden. Beveilig de extruder met de spuiten in de extruder behuizing en zet vast. </li><li> Passeren het water door de extruder door langzaam te duwen het water uit een spuit in de andere. Dit vertegenwoordigt een passage. Herhaal dit voor een totaal van drie passages ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn aanwezig. Verwijder de spuit met water en gooi het water. </li><li> Vul een spuit met het monster, hechten aan de extruder, en langzaam langs de vesicle oplossing door het membraan zoals hierboven beschreven in stap 4.3. 10x herhalen voor een totaal van 11 passages. Aangezien het extrusieproces opbrengst, zal het monster minder troebel en gemakkelijker te duwen over het membraan worden. Een plotselinge daling van de weerstand, echter, geeft meestal een scheuring van het membraan. </li><li> Breng de geëxtrudeerde blaasje oplossing en maken 40 pi fracties van de blaasjes in microcentrifugebuizen.Flits bevriezen elke hoeveelheid wordt in droogijs of in vloeibare stikstof. </li><li> Lyophilize elk aliquot met een centrifugale verdamper overnacht bij 30 ° C. Bewaar de gevriesdroogde lege blaasjes bij -20 ° C. </li></ol> 5. Inkapselen transcriptie-vertaling Machinery <ol><li> Meng de bestanddelen van de transcriptie-translatiereactie en voeg 20 eenheden RNase-remmer. Incubeer op ijs. </li><li> Voeg de DNA-template. Een controlereactie, 250 ng een plasmide coderend mVenus of een soortgelijk fluorescerend eiwit achter een T7 transcriptionele promoter en een sterke E. coli ribosoom bindingsplaats wordt aanbevolen. </li><li> Breng het uiteindelijke volume op 25 ul met RNase-vrij water. </li><li> Hydraat een hoeveelheid gevriesdroogd vesicles (uit stap 4.6) met 10 ul van het reactiemengsel verzameld in stap 5.3. Kort vortex het mengsel totdat de vesicles worden geresuspendeerd. Dit moet in minder dan 30 sec. </li><li> Incubeer het reactiemengsel op ijs gedurende 30 min om de vesicles te zwellen. </li><li> Verdun het blaasje mengsel 20-voudig tot een eindvolume van 30 ul door toevoegen van 1,5 ul vesicles in 27,0 gl 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4 en 1,5 pi van 20,2 mg / ml Proteïnase K. DNase en RNase ook op dit punt worden toegevoegd als alternatief voor proteinase K extravesicular materiaal degraderen. </li><li> Incubeer gedurende ten minste 2,5 uur bij 37 ° C. </li></ol> 6. Microscopie <ol><li> Onderzoekt de blaasjes en de voortgang van fluorescerend eiwit productie op verschillende tijdstippen. De blaasjes hebben een grotere diameter dan de 400 nm poriegrootte van het membraan voor vesicle extrusie. <ol><li> Bereid een monsterkamer door het plaatsen van een 20 x 5 mm silicium spacer op een standaard microscoop dia. Pipetteer 10 ul van vesicles in de monsterkamer. Plaats een gesiliconiseerde glazen deksel slip op de kamer. </li><li> Let op de blaasjes met een 63X olie-dispersie or soortgelijke doelstelling van helder veld en fluorescentie microscopie met de juiste filter set voor de uitgebuite fluorescerend eiwit. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthesis+of+a+minimal+cell.">Towards synthesis of a minimal cell.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).</li><li>Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+artificial+cell,+from+self-organization+to+computation+and+self-reproduction.">Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+Exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).</li><li>Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Proteins+through+In+Vitro+Protein+Synthesis+in+Liposomes.">Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).</li><li>Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imitations.">Cellular imitations.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).</li><li>Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+chemical+synthetic+biology.">Approaches to chemical synthetic biology.</a> FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).</li><li>Noireaux, V., Shin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).</li><li>Fujiwara, K., Nomura, S. -. i. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+an+Additive-Free+Cell+Extract+to+Mimic+the+Conditions+of+Live+Cells.">Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells.</a> PLoS ONE. 8, e54155 (2013).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Study+of+the+Structure+of+Multilamellar+Giant+Liposomes+As+a+Container+of+Protein+Synthesis+Reaction.">Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction.</a> Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).</li><li>Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protiens+Within+Liposomes.">Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes.</a> Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).</li><li>Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+liposomes+with+a+minimal+set+of+enzymes.">Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).</li><li>Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimal+Size+of+Liposome-Based+Model+Cells+Brings+about+a+Remarkably+Enhanced+Entrapment+and+Protein+Synthesis.">The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis.</a> ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Vesicle+Fusion+Triggers+Gene+Expression.">Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression.</a> Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+artificial+cell+based+on+gene+expression+in+vesicles.">Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles.</a> Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controllable+gene+expression+system+in+liposomes+that+includes+a+postive+feedback+loop.">A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop.</a> Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).</li><li>Martini, L., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-like+Systems+with+Riboswitch+Controlled+Gene+Expression.">Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression.</a> Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Association+and+Fusion+of+Giant+Vesicles+Using+a+Fluorescence-Activated+Cell+Sorter.">Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter.</a> Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Tracking+of+a+Minimum+Gene+Expression+System+Reconstituted+in+Giant+Liposomes.">Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes.</a> ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).</li><li>Lentini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+and+in+Vitro+Genetic+Organization+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth. Biol. , (2013).</li><li>Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigene+Expression+In+Vivo:+Supremacy+of+Large+Versus+Small+Terminators+for+T7+RNA+Polymerase.">Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).</li><li>Trochilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , (2003).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protein+in+Liposome.">Synthesis of Functional Protein in Liposome.</a> J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+vesicles+composed+of+monocarboxylic+or+dicarboxylic+fatty+acids+and+trimethylammonium+amphiphiles.">Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles.</a> Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).</li><li>Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+crowding+of+ribosomes+and+proteins+inside+vesicles:+a+possible+mechanism+for+the+origin+of+cell+metabolism.">Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism.</a> ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).</li><li>Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+mRNA+Measurement+during+an+in+Vitro+Transcription+and+Translation+Reaction+Using+Binary+Probes.">Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes.</a> ACS Synth. Biol. 10, (2012).</li><li>St&#246;gbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., R&#228;dler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiment+and+mathematical+modeling+of+gene+expression+dynamics+in+a+cell-free+system.">Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system.</a> Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).</li><li>Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+emergent+properties+of+a+synthetic+quasi-cellular+system.">Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system.</a> BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Large+Monodisperse+Vesicles.">Preparation of Large Monodisperse Vesicles.</a> PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel celvrije synthetische biologie staat nog in de kinderschoenen, voorschotten een basis gelegd van waaruit steeds complexer cel-achtige systemen kan worden gemaakt. De reconstructie van de transcriptie-translatie machinerie van volledig gedefinieerd onderdelen 9 binnenkant van blaasjes 28 was bijzonder belangrijk in het faciliteren van latere inspanningen bij de bouw van milieuvriendelijke responsieve kunstmatige cells17, 18. Zo hebben kunstmatige cel studies zijn gebruikt om evolutionaire processen sonde 4,29,30, de mechanistische details van de RNA-en eiwitsynthese 22,31, de invloeden van metabole load32, 33, en de assemblage van virusdeeltjes 34. Belangrijker, bestaat voldoende kennis nu dat elementaire cellulaire functie kunnen binnen worden gereconstitueerd van blaasjes in het laboratorium het volgen van deze eerdere rapporten en de hierin beschreven protocollen. Behalve dat het gemakkelijk, de beschreven inkapseling procedure heeft een aantal voordelen. Zo kunnen veel lege gelyofiliseerd vesicle aliquots worden vooraf opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik. Het protocol is niet onderhevig biologische moleculen aan organische oplosmiddelen, grote temperatuurschommelingen of lange periodes van dialyse. We verwachten dat de zachtheid van de procedure de opname van extra componenten zoals nodig zal vergemakkelijken. We hebben ook niet waargenomen nadelige effecten op het veranderen van de samenstelling van de lipide membraan op inkapselen en transcriptie-translatie efficiency. Daarom lipiden ontvankelijker voor de opname van membraaneiwitten, specifieke morfologie of visualisatie denkbaar worden benut. De belangrijkste beperking van de beschreven methode is dat de verkregen vesicles niet homogeen in grootte of lamellarity. Voor veel toepassingen zijn deze problemen niet interfereren met de interpretatie van de gegevens. Echter, indien nodig, aanvullende stappen worden opgenomen om smalle ee grootteverdeling en de lagen van membranen, zoals verdere rondes van extrusie verminderen na inkapseling, vriesdooien, dialyse of 35. Ongetwijfeld betere methoden die deze en andere problemen te omzeilen worden ontwikkeld. Tot die tijd, vinden we het hier beschreven protocol goed geschikt voor de bouw van cellulaire nabootst.

Celvrije, in vitro transcriptie-translatie reacties en de vorming van vesicles van synthetische lipiden zijn niet nieuw. Echter, het combineren van de twee in een cellulair nabootsen aanzienlijk challenging1-6. E. coli celextracten met of zonder T7 RNA polymerase kan worden gebruikt als een bron van transcriptie-translatie 7,8. Celextracten profiteren van de aanwezigheid van extra cellulaire componenten die eiwitexpressie en vouwen kunnen vergemakkelijken. Als alternatief, een mix van individueel gezuiverd RNA en eiwitmoleculen, dat wil zeggen de PURE systeem 9, kan worden gebruikt om intravesicular eiwitsynthese bemiddelen 4,10-14. De PURE-systeem maakt het mogelijk voor de bouw van volledig gedefinieerd cellulaire mimiek en heeft geen last van de nucleaseactiviteit gevonden in cel extracten. Praktisch betekent dit dat minder template DNA nodig, waardoor faciliteren van lage inkapseling efficiëntie 11 </sup&gt;. Hoewel minder vaak gebruikt, kunnen cellulaire nabootsers worden gebouwd met celextracten afgeleid van eukaryote cells15. Tot dusverre zijn genetisch gecodeerde ingekapselde cascades en cellulaire bootst het milieu zin gerapporteerd 16-18. De eenvoudigste manier om transcriptie-translatie reacties volgen is om de fluorescentie of luminescentie van genetisch gecodeerd elementen te meten. Typisch, vuurvlieg luciferase of GFP 19 worden gebruikt, hoewel in vitro reacties worden vaak gemeten door radiolabeling. Fluorescentie detectie maakt bovendien voor de monitoring van populaties van blaasjes 20,21 via cytometrie gebaseerde methoden, en biedt daarmee enig inzicht in de stochastische aard van de biologische-achtige processen. Deze controle methoden zijn gebruikt om een kleine set van ontwerpregels en een bibliotheek van onderdelen uit te bouwen, inclusief een verzameling van fluorescente eiwitten die geschikt i zijn gedefinieerdn vitro transcriptie-translatie 22, de invloed van genetische organisatie expressie 22, de activiteit van sigmafactoren 16 en de doelmatigheid van transcriptionele terminators 23. Toch blijft er nog veel dat moet worden gedaan naar de mogelijkheid van het bouwen voorspelbaar in vitro genetisch gecodeerd apparaten te verhogen. Er zijn vele methoden beschikbaar om blaasjes te maken. De meest voorkomende werkwijzen afhankelijk van de vorming van een dunne lipide film op een glazen oppervlak, gevolgd door resuspensie in waterige Solution24. Als de waterige oplossing bevat transcriptie-translatie, bijvoorbeeld, dan een fractie van de vesicles zal de vereiste componenten voor eiwitproductie bevatten. De inkapselingsefficiëntie van dergelijke werkwijzen is laag, wat betekent dat slechts een klein percentage van vesicles actief. Vele alternatieve methoden gekenmerkt door veel hogere inkapseling efficiency benutten de omzetting van water-in-olie emulsie druppeltjes aan blaasjes. Hoewel het waarschijnlijk is dat dergelijke werkwijzen gemeengoed zal in de toekomst nog deze methoden lijden aan de noodzaak van speciale apparatuur en geven vesicles met gewijzigde membraan preparaten 25. Een duidelijk voordeel van het water-in-olie vesicle werkwijzen is de mogelijkheid om membraan lamellarity controleren. De hierin beschreven werkwijze is gebaseerd op de dunne vetfilm protocol beschreven door de Yomo laboratorium 11 met kleine aanpassingen waaronder extra homogenisatiestap. Deze methode is eenvoudig, goedkoop, en geeft robuuste blaasjes goed geschikt voor het inkapselen van transcriptie-translatie machinerie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

Naarmate de belangstelling verschuift van individuele moleculen tot systemen van moleculen, hebben een toenemend aantal laboratoria getracht bouwen van onderop cellulaire bootst die beter vertegenwoordigen de complexiteit van cellulaire leven. Tot op heden zijn er een aantal paden die kunnen worden genomen om gecompartimenteerde cellulaire nabootst, met inbegrip van onderzoek water-in-olie emulsies, microfluïdische apparaten, en vesicles. Elk van de beschikbare opties heeft specifieke voor-en nadelen. Bijvoorbeeld, water-in-olie emulsies geven hoge inkapselingsefficiëntie maar niet goed bootsen de barrièrelaag van levende cellen. Het belangrijkste voordeel van de hierin beschreven werkwijzen is dat ze allemaal gemakkelijk en goedkoop uit te voeren. Transcriptie-translatie is ingekapseld binnen fosfolipide blaasjes door een proces dat gemeenschappelijke instrumenten, zoals een centrifugale verdamper en een extruder exploiteert. Reacties worden gecontroleerd door fluorescentie spectroscopie. Het protocols kan worden aangepast voor recombinant eiwit expressie, de bouw van cellulaire mimiek, de verkenning van de minimumeisen voor cellulaire leven, of de assemblage van genetische circuits.

Fluorescentie microscopie blijkt dat fluorescentie wordt alleen waargenomen in de vesicles, omdat extravesicular materiaal enzymatisch afgebroken (Figuur 3). Voor de expressie van mVenus, intravesicular fluorescentie begint te worden waargenomen na 1,5 uur bij 37 ° C en bereikt maximale fluorescentie-intensiteit binnen 6 uur. De optimale temperatuur en incubatietijd kan variëren afhankelijk van de specifieke gebruikte constructen. Uiteenlopende fluorescente proteïnen rijpen heel anders bij een temperatuur afhankelijke manier. Met andere woorden, de waarneming van eiwitproductie is niet alleen afhankelijk van eiwitsynthese en de vouwing, maar ook de vorming chromofoor. Gemiddelde eiwitsynthese kan worden verhoogd door het opnemen membraaneiwit poriën om een instroom van verarmd componenten die voor de transcriptie en translatie 27. Het wordt aanbevolen voor het uitvoeren van een analoge transcriptie-vertalingentie reactie in de afwezigheid van vesicles te garanderen dat de geëxploiteerde genetische construct functioneel. Deze controle reactie wordt gemakkelijker gecontroleerd door fluorescentie spectroscopie dan microscopie. Figuur 4 toont een in vitro transcriptie-translatie reactie van een construct coderend mVenus. Ingekapselde reacties geven veel hogere totale fluorescentie-intensiteiten dan vergelijkbare intravesicular reacties. Dit komt door inkapseling efficiëntie en omdat het totale volume intravesicular is veel minder dan de extravesicular volume (een verdunning effect). <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Figuur 1. De roterende verdamper en de vacuümpomp. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . Figuur 2. De behuizing en onderdelen van de extruder worden afzonderlijk weergegeven. Van links naar rechts, spuit, tegenhoudmoer, teflon lagers, interne membraan ondersteunt met zwarte O-ringen tegenover elkaar, extruder buitenmantel, en tweede spuit. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . Figuur 3 Fluorescentie beelden van mVenus eiwitproductie in liposomen A en C:.. Helderveld beelden van multilamellaire blaasjes na 1,5 uur en 2,5 uur B &amp;# 160; D: De productie van mVenus is gevisualiseerd door fluorescentie (groen gekleurd) na 1,5 en 2,5 uur, respectievelijk. Schaal bar is 20 micrometer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> Figuur 4. In vitro controlereactie van ingekapseld in vitro transcriptie en translatie van mVenus. Fluorescentie-intensiteit werd gemeten elke 5 minuten over 4 uur. De gegevens werden verkregen met een Real-Time PCR-instrument. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> .

Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Hierin beschrijven we eenvoudige werkwijzen voor de bereiding van vesicles, de inkapseling van transcriptie en translatie, en de controle van eiwitproductie. De verkregen celvrije systemen kunnen worden gebruikt als een uitgangspunt steeds complexe cellulaire nabootst.

De inkapseling van de Cell-free transcriptie en vertaling Machines in Blaasjes voor de bouw van Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Een methode voor ovariële follikel Encapsulation en cultuur in een proteolytisch Afbreekbare 3 dimensionale systeem

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Het beschrijven van een transcriptiefactor Afhankelijk verordening van het MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

NanoPrecipitation Flash voor de inkapseling van hydrofobe en hydrofiele stoffen in polymere nanodeeltjes

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Meten mondiale cellulaire Matrix Metalloproteinase en metabole activiteit in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Evaluatie van de opslag stabiliteit van extracellulaire blaasjes

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...