Name: the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics
Uploaded: 2013-10-21T20:30:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

Forfatterne erkjenner Armenise-Harvard Foundation, Marie-Curie Trentino COFUND (ACS), den autonome provinsen Trento (ecomm), og CIBIO for finansiering.

En. Klargjøring av DNA mal <ol><li> Rens plasmid fra en standard laboratorie-stamme av E. coli, for eksempel E. coli DH5a eller Nova blå med et kommersielt kit. Alternativt kan en lineær PCR-produkt blir renset på samme måte med et kommersielt kit. Eluer DNA med H 2 O bare. </li><li> Fenol-kloroform trekke ut DNA løsning 26. </li><li> Bestem DNA-konsentrasjon og renhet, for eksempel ved UV-absorbans eller andre egnede metoder. Det er viktig å benytte meget rent DNA for effektiv transkripsjon-oversettelse. </li></ol> 2. Klargjøring av Thin Lipid Film <ol><li> Vei tørt lipid pulver og oppløses i løsemiddel. For 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (POPC), er stamløsninger fremstilt i kloroform ved en konsentrasjon på 40 mg / ml. Merk: Organiske løsemidler må alltid håndteres med glass pipetter og flasker. Med andre ord må plast aldri brukes. Butikken sTock løsninger i lufttette, løsemiddelbestandige rav glassflasker ved -20 ° C, helst under argon. </li><li> Delmengde 12 mikromol POPC (220 pl av 40 mg / ml stamløsning) inn i en 5 ml rundbunnet kolbe. </li><li> Fordamp løsningsmidlet med en rotasjonsfordamper (figur 1) for å generere tynn lipidfilm. <ol><li> Fest forsvarlig rundbunnet kolbe destillasjon til røret med en sirkulær klemme og starte rotasjon av kolben. </li><li> Initiere sirkulasjonen av vann gjennom kondensatoren. Ved hjelp av en varme bad er ikke nødvendig, fordi kloroform har et lavt kokepunkt på 61,2 ° C ved normalt atmosfærisk trykk. </li><li> Sikre at systemet er åpen til atmosfæren ved å kontrollere at stoppekranen er åpen. Slå på vakuumpumpen og langsomt lukker stoppekran for å påføre vakuum til systemet. </li><li> En tynn lipidfilm avsettes på veggene i rund-bunnet kolbe under rotasjonsfordampning danner en ugjennomsiktig filmsom er synlig på øyemål. La rotasjonsinndamping fortsette i 0,5-2 timer. Å stoppe prosessen, sakte slipper vakuumtrykket, stoppe rotasjonen, og fjern rund bunn kolbe. </li></ol></li></ol> 3. Lipid resuspendering og Vesikkel Homogenisering <ol><li> Tilsett 1 ml 18,2 MΩ H 2 O til tynn lipidfilm direkte i rundbunnet kolbe. Kraft vortex løsningen ved maksimal hastighet, omtrent 3200 rpm, inntil lipidfilmen løsner fra glass, som er observerbar ved øyet. </li><li> Overfør lipid dispersjonen inn i et 2 ml mikrosentrifugerør. </li><li> Sette opp en ring stå å holde en homogenisator med en 5 mm spiss. Plasser en mikrosentrifuge stå under homogenisatoren å sikkert holde lipid spredning. Skyll den dispergerende element av homogenisatoren ved å dyppe den i spiss 18.2 MΩ H2O og kjørt i noen sekunder. </li><li> Plasser den dispergerende elementet direkte inn i lipid-dispersjon som sikrer thpå spissen ikke berører bunnen av mikrosentrifugerør. Homogenisere i 1 min ved styrkenivå 4 eller 14 000 rpm. </li></ol> 4. Vesikkelen Extrusion og Lyophilization <ol><li> Monter delene mini-ekstruder (figur 2), som består av et ytre hus og en låsemutter som huser to Teflon indre membran støtter, to O-ringer, teflon og en peiling. <ol><li> Plasser de to O-ringene inn i sporene i de indre membran-støtter. Prewet to filtre og en 400 nm membran. Filtrene skal plasseres mot Teflon innsiden av O-ringer med membran mellom dem. </li><li> Plasser membranen støtter, til ekstruderen utside med membranen omgitt av to filtre i mellom O-ringene. Plasser Teflon peiling på innsiden av huset og fest holderen mutteren og stram for hånd. </li></ol></li><li> Skyll to sprøyter og fylle en med 18,2 MΩ vann. Sett sprøyten nåler i den lille hOles i Teflon på hver ende av ekstruder forsamlingen. Nålene skal gli lett inn, ikke tvinge nålene. Fest ekstruder med sprøyter inn i ekstruder bolig og sy. </li><li> Passerer vannet gjennom ekstruderen ved sakte presser vannet ut av en sprøyte og inn i den andre. Dette representerer en passasje. Gjenta for totalt tre passasjer som sikrer at det ikke er noen lekkasjer tilstede. Fjern sprøyten med vann og kast vannet. </li><li> Fylle en sprøyte med prøven, fester til ekstruderen, og langsomt passere vesikkel-løsningen gjennom membranen som beskrevet ovenfor i trinn 4.3. Gjenta 10x for totalt 11 passasjer. Som ekstrusjonsprosessen skrider frem, vil prøven bli mindre grumset og lettere å presse over membranen. En plutselig reduksjon i motstanden, tyder imidlertid vanligvis en brist i membranen. </li><li> Overfør den ekstruderte vesikkel-løsning og gjøre 40 pl aliquoter av vesiklene inn i mikrosentrifugerør.Flash fryse hver prøve i enten tørris eller i flytende nitrogen. </li><li> Lyophilize hver porsjon med en sentrifugal fordamper over natten ved 30 ° C. Oppbevar lyofiliserte tomme blærer ved -20 ° C. </li></ol> 5. Innkapsle transkripsjon-oversettelse Machinery <ol><li> Bland bestanddelene i transkripsjon-translation reaksjon og tilsett 20 enheter RNase inhibitor. Inkuber på is. </li><li> Legg DNA mal. For en kontroll reaksjon, 250 ng av et plasmid som koder mVenus eller et lignende fluorescerende protein bak en T7 transkripsjons-promotor og en sterk E. coli ribosombindingssete anbefales. </li><li> Bring sluttvolumet til 25 pl med RNase-fritt vann. </li><li> Hydrat en alikvot av lyofiliserte vesikler (punkt 4.6) med 10 pl av reaksjonsblandingen satt sammen i trinn 5.3. Kort vortex blandingen inntil den vesikler ble resuspendert. Dette bør ta mindre enn 30 sek. </li><li> Inkuber reaksjonsblandingen på is i tre0 min for å tillate vesiklene til å svelle. </li><li> Fortynn vesikkel blandingen 20 ganger til et endelig volum på 30 ul ved tilsetning av 1,5 mL av vesikler i 27,0 pl av 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4 og 1,5 pl av 20.2 mg / ml Proteinase K. DNase og RNase kan også tilsettes ved dette punktet som et alternativ til proteinase K for å degradere extravesicular materiale. </li><li> Inkuber i minst 2,5 timer ved 37 ° C. </li></ol> 6. Mikroskopi <ol><li> Undersøke blemmer og fremdriften av fluorescerende protein produksjon på ulike tidspunkt. De vesikler vil ha en større diameter enn 400 nm pore-størrelse av membranen som brukes for vesikkel ekstrudering. <ol><li> Forbered en prøve kammer ved å plassere en 20 x 5 mm silisium spacer på en standard mikroskop lysbilde. Pipetter 10 pl vesikler inn i prøvekammeret. Plasser en silikonisert glassdekselstrimmel over kammeret. </li><li> Observer vesikler med en 63X olje-spredning or lik målet ved lyse felt og fluorescens mikroskopi med riktig filter satt for utnyttet fluorescerende protein. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthesis+of+a+minimal+cell.">Towards synthesis of a minimal cell.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).</li><li>Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+artificial+cell,+from+self-organization+to+computation+and+self-reproduction.">Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+Exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).</li><li>Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Proteins+through+In+Vitro+Protein+Synthesis+in+Liposomes.">Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).</li><li>Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imitations.">Cellular imitations.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).</li><li>Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+chemical+synthetic+biology.">Approaches to chemical synthetic biology.</a> FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).</li><li>Noireaux, V., Shin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).</li><li>Fujiwara, K., Nomura, S. -. i. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+an+Additive-Free+Cell+Extract+to+Mimic+the+Conditions+of+Live+Cells.">Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells.</a> PLoS ONE. 8, e54155 (2013).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Study+of+the+Structure+of+Multilamellar+Giant+Liposomes+As+a+Container+of+Protein+Synthesis+Reaction.">Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction.</a> Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).</li><li>Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protiens+Within+Liposomes.">Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes.</a> Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).</li><li>Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+liposomes+with+a+minimal+set+of+enzymes.">Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).</li><li>Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimal+Size+of+Liposome-Based+Model+Cells+Brings+about+a+Remarkably+Enhanced+Entrapment+and+Protein+Synthesis.">The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis.</a> ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Vesicle+Fusion+Triggers+Gene+Expression.">Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression.</a> Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+artificial+cell+based+on+gene+expression+in+vesicles.">Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles.</a> Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controllable+gene+expression+system+in+liposomes+that+includes+a+postive+feedback+loop.">A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop.</a> Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).</li><li>Martini, L., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-like+Systems+with+Riboswitch+Controlled+Gene+Expression.">Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression.</a> Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Association+and+Fusion+of+Giant+Vesicles+Using+a+Fluorescence-Activated+Cell+Sorter.">Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter.</a> Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Tracking+of+a+Minimum+Gene+Expression+System+Reconstituted+in+Giant+Liposomes.">Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes.</a> ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).</li><li>Lentini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+and+in+Vitro+Genetic+Organization+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth. Biol. , (2013).</li><li>Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigene+Expression+In+Vivo:+Supremacy+of+Large+Versus+Small+Terminators+for+T7+RNA+Polymerase.">Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).</li><li>Trochilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , (2003).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protein+in+Liposome.">Synthesis of Functional Protein in Liposome.</a> J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+vesicles+composed+of+monocarboxylic+or+dicarboxylic+fatty+acids+and+trimethylammonium+amphiphiles.">Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles.</a> Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).</li><li>Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+crowding+of+ribosomes+and+proteins+inside+vesicles:+a+possible+mechanism+for+the+origin+of+cell+metabolism.">Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism.</a> ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).</li><li>Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+mRNA+Measurement+during+an+in+Vitro+Transcription+and+Translation+Reaction+Using+Binary+Probes.">Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes.</a> ACS Synth. Biol. 10, (2012).</li><li>St&#246;gbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., R&#228;dler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiment+and+mathematical+modeling+of+gene+expression+dynamics+in+a+cell-free+system.">Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system.</a> Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).</li><li>Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+emergent+properties+of+a+synthetic+quasi-cellular+system.">Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system.</a> BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Large+Monodisperse+Vesicles.">Preparation of Large Monodisperse Vesicles.</a> PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Selv om celle-fri syntetisk biologi er fortsatt i sin spede begynnelse, har fremskritt lagt et fundament som stadig mer komplekse celle-lignende systemer kan gjøres. Tilberedning av transkripsjon-oversettelse maskiner fra fullstendig definert komponenter ni innsiden av vesikler 28 var spesielt viktig å tilrettelegge senere innsats i å bygge miljøvennlig responsive kunstig cells17, 18 år. Tilsvarende har kunstige celle studier blitt brukt til å sondere evolusjonære prosesser 4,29,30, de mekanistiske detaljer om RNA og proteinsyntese 22,31, påvirkning av load32 metabolske, 33, og montering av viruspartikler 34. Viktigere, finnes nok kunnskap nå at grunnleggende cellular funksjon kan tilberedes på innsiden av blemmer i laboratoriet følge disse tidligere rapporter og protokoller som er beskrevet her. I tillegg til å være enkel, den beskrevne innkapsling procedure har flere fordeler. For eksempel kan mange tomme, lyofiliserte vesikkel alikvoter gjøres på forhånd og lagret ved -20 ° C for senere bruk. Protokollen ikke underlagt biologiske molekyler for organiske løsemidler, drastiske temperaturendringer, eller lange perioder med dialyse. Vi forventer at mildhet av prosedyren vil lette innlemmelsen av flere komponenter som trengs. Vi har ikke observert bivirkninger å endre kravet til lipidsammensetningen av membranen på innkapsling eller transkripsjon-oversettelse effektivitet. Derfor kan lipider mere anvendbare for inkorporering av membran proteiner, spesifikke morfologi eller visualisering tenkes å bli utnyttet. Den viktigste begrensning av den beskrevne fremgangsmåte er at de resulterende vesikler er ikke homogent i størrelse eller lamellarity. For mange programmer, disse vanskelighetene ikke forstyrre tolkningen av data. Men hvis det er nødvendig, kan ytterligere tiltak bli tatt med for å smale the størrelsesfordeling og redusere lagene av membraner, som for eksempel ytterligere runder ekstrudering etter innkapsling, fryse-tining, eller dialyse 35.. Utvilsomt bedre metoder som omgår disse og andre problemer vil bli utviklet. Inntil da, finner vi protokollen beskrevet her å være godt egnet for bygging av mobilnettet etterligner.

Cellefritt in vitro transkripsjon-translation reaksjoner og generering av vesikler fra syntetiske lipider er ikke noe nytt. Men å kombinere de to til en mobil etterligne er betydelig mer challenging1-6. E. coli-celle ekstrakter med og uten T7 RNA-polymerase kan bli brukt som en kilde for transkripsjon-translation maskineri 7,8. Celle ekstrakter nytte av tilstedeværelsen av flere cellulære komponenter som kan lette protein uttrykk og folding. Alternativt kan en blanding av hver for seg rensede RNA-og protein-molekyler, dvs. PURE system 9, kan brukes til å mediere intravesicular proteinsyntese 4,10-14. PURE systemet tillater for bygging av fullt definerte mobilnettet etterligner og ikke lider av den nukleaseaktivitet funnet i celle ekstrakter. Praktisk talt, betyr dette at mye mindre DNA mal er nødvendig, og dermed tilrettelegge prosesser med lav innkapslingseffektiviteten 11 </sup&gt;. Selv om mindre hyppig brukt, kan cellulære etterligner bygges med celle ekstrakter utvunnet fra eukaryote cells15. Så langt har genetisk kodet innkapslede kaskader og cellulære etterligner den forstand miljøet blitt rapportert 16-18. Den enkleste måten å overvåke transkripsjon-oversettelse reaksjoner er å måle fluorescens eller luminescens av genetisk kodet elementer. Vanligvis er ildflue luciferase 19 eller GFP brukt, selv om in vitro reaksjoner er ofte måles ved radiomerking. Fluorescensdeteksjon gjør i tillegg til overvåking av bestandene av vesikler 20,21 gjennom cytometry baserte metoder, og dermed gir en viss innsikt i den stokastiske natur biologisk-lignende prosesser. Disse overvåking metoder har blitt brukt til å definere et lite sett med design regler og et bibliotek av deler for å bygge mellom, inkludert en samling av fluorescerende proteiner som er kompatible med in vitro transkripsjon-oversettelse 22, påvirkning av genetisk organisasjon på ekspresjon 22, aktiviteten av sigma faktorer 16, og effektiviteten av transkripsjonelle terminatorer 23. Ikke desto mindre er det fortsatt mye som må gjøres for å øke evnen til å bygge forutsigbar in vitro, som genetisk er kodet enheter. Det finnes mange metoder for å lage blærer. De mest vanlige metoder avhengig av genereringen av en tynn lipidfilm i en glassoverflate etterfulgt av resuspendering i vandig solution24. Hvis den vandige oppløsning inneholder transkripsjon-translation maskiner, for eksempel, så en brøkdel av vesiklene dannes vil inneholde de nødvendige komponenter for protein produksjon. Imidlertid er innkapslingseffektiviteten av slike metoder lav, hvilket betyr at bare en liten prosentandel av vesikler som er aktive. Mange av de alternative metoder, nemlig langt høyere innkapsling efficiency utnytte omdannelsen av vann-i-olje-emulsjon dråpene vesikler. Selv om det er sannsynlig at slike metoder vil være vanlig i fremtiden, for tiden disse metoder lider av behovet for spesialisert utstyr og gir vesikler med endrede membran preparater 25.. En klar fordel med vann-i-olje til vesikkel metoder er mulighet for å kontrollere membran lamellarity. Metoden som er beskrevet her er basert på tynn lipidfilm protokollen beskrevet av Yomo laboratorium 11 med liten modifikasjoner inkludert en ytterligere homogenisering trinn. Denne metoden er enkel, billig, og gir robuste blemmer godt egnet for innkapsling av transkripsjon-oversettelse maskiner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

Som interesse skift fra individuelle molekyler til systemer av molekyler, har et økende antall laboratorier søkt å bygge fra bunnen opp mobilnettet etterligner som bedre representerer kompleksiteten i mobilnettet liv. Til dags dato er det en rekke stier som kan tas for å bygge compartmentalized mobilnettet etterligner, inkludert utnyttelse av vann-i-olje emulsjoner, microfluidic enheter og blemmer. Hver av de tilgjengelige alternativene har spesifikke fordeler og ulemper. For eksempel, vann-i-olje-emulsjoner som gir høy innkapslingseffektivitet, men ikke etterligne vel permeabiliteten barriere av levende celler. Den primære fordelen av metodene beskrevet her er at de alle er enkelt og billig å gjennomføre. Transcription-translation maskineri er innkapslet på innsiden av fosfolipid-vesikler gjennom en prosess som utnytter vanlige instrumentene, for eksempel en sentrifugal fordamper og en ekstruder. Reaksjonene overvåkes av fluorescens spektroskopi. Protokollens kan tilpasses for rekombinant protein uttrykk, bygging av mobilnettet etterligner, utforskning av minstekravene for mobilnettet livet, eller montering av genetiske kretser.

Fluorescens mikroskopi viser at fluorescens bare observert inne i vesiklene, fordi extravesicular materiale er enzymatisk nedbrutt (figur 3). For ekspresjon av mVenus, begynner intravesicular fluorescens å bli observert etter 1,5 timer ved 37 ° C og når maksimal fluorescens intensitet innen 6 timer. Den optimale temperatur og inkubasjonstid kan variere avhengig av de spesifikke konstruksjoner som benyttes. For eksempel ulike fluorescerende proteiner modnes ganske annerledes i en temperaturavhengig måte. Med andre ord, er observasjon av proteinproduksjon ikke utelukkende avhengig av proteinsyntese og folding, men også på kromofor formasjon. Generell proteinsyntese kan økes ved å inkorporere membranprotein porer for å tillate en strøm av utarmet komponentene som er nødvendige for transkripsjon og translasjon 27.. Det anbefales å gjennomføre en tilsvarende transkripsjon-omregsjon reaksjon i fravær av vesiklene for å sikre at den utnyttes genetisk konstruere er funksjonell. Denne kontrollen reaksjon er lettere overvåket av fluorescens spektroskopi snarere enn mikroskopi. Figur 4 viser en in vitro transkripsjon-oversettelse reaksjon av en konstruksjon koding mVenus. Uinnkapslet reaksjoner gi mye høyere sum fluorescensintensiteter enn tilsvarende intravesicular reaksjoner. Dette skyldes innkapslingseffektivitet og fordi den totale intravesicular volum er mye mindre enn den extravesicular volum (dvs. en fortynning effekt). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Figur 1. Den roterende fordamper og vakuumpumpe. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . Figur 2. Kapslingen og deler av ekstruderen er vist separat. Fra venstre til høyre, støtter sprøyte, retainer mutter, teflon peiling, intern membran med sorte O-ringer som vender mot hverandre, ekstruder utside, og andre sprøyte. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . Figur 3 Fluorescens bilder av mVenus protein produksjon i liposomer A og C:.. Bright feltet bilder av multilamellære blemmer etter 1,5 timer og 2,5 timer B &amp;# 160; D: Produksjonen av mVenus er visualisert ved fluorescens (farget grønn) etter 1,5 og 2,5 timer, henholdsvis. Scale bar er 20 mikrometer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> . <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> Figur 4. In vitro kontroll reaksjon nonencapsulated in vitro transkripsjon og oversettelse av mVenus. Fluorescensintensitet ble målt hvert 5 min i mer enn 4 timer. Dataene ble kjøpt med en Real-Time PCR instrument. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> .

Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Heri vi beskriver enkle metoder for fremstilling av vesikler, innkapsling av transkripsjon og translasjon maskineri, og overvåking av protein produksjon. Den resulterende celle-frie systemer kan brukes som et utgangspunkt for å bygge stadig mer komplekse cellulære etterligner.

Den Innkapsling av Cell-free transkripsjon og oversettelse Machinery i Blemmer for bygging av Cellular Etterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Beskrive en transkripsjonsfaktor Avhengig Regulering av mikroRNA transkriptom

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Bygging av Modular Hydrogel blad for Micropatterned Macro-skalert 3D Cellular Arkitektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Repressing Gene transkripsjon av omadresserer cellulære maskiner med kjemiske Epigenetic modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Flash NanoPrecipitation for innkapsling av hydrofobe og hydrofile forbindelser i polymere nanopartikler

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Måling av Global mobilnettet matrise Metalloproteinase og metabolsk aktivitet i 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Evaluering av lagrings stabiliteten til ekstracellulære blemmer

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forbereder proteinproduserende syntetiske celler ved hjelp av cellefrie bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsjonsoverføring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...