Name: use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model at JoVE.com

Den her beskrevne arbejde blev finansieret af det amerikanske Department of Veterans Affairs Biomedicinsk Laboratorium Forskning og Udvikling BX001686-1A1 og VA Rehabilitering forskning og udvikling.

1.. Plating og vedligeholdelse af Cell Culture <ol><li> Varm Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kulturmedium (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin / Neomycin) til 37 ° C. </li><li> Opnå lager af frosne A12 celler fra -80 ° C. </li><li> Hurtigt optø cellerne i 37 ° C vandbad; Optøede, forsigtigt pipette celler til at overføre til en 75 cm 2 ventileret kultur kolbe og tilsættes 10 ml af dyrkningsmedier. </li><li> Inkuber kolbe natten over i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Aspirer...

<ol>
	<li>Akil, L., Ahmad, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+obesity+and+cardiovascular+diseases+in+four+southern+states+and+Colorado.">Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado.</a> J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).</li><li>Posey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+proinflammatory+lipid+accumulation,+inflammation,+and+insulin+resistance+in+rats+fed+a+high-fat+diet.">Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).</li><li>Moraes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet+induces+apoptosis+of+hypothalamic+neurons.">High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons.</a> PloS one. 4, (2009).</li><li>Mayer, C. M., Belsham, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+attenuates+insulin+signaling+and+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+apoptosis+in+hypothalamic+neurons:+rescue+of+resistance+and+apoptosis+through+adenosine+5'+monophosphate-activated+protein+kinase+activation.">Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation.</a> Endocrinology. 151, 576-585 (2010).</li><li>Benoit, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+acid+mediates+hypothalamic+insulin+resistance+by+altering+PKC-theta+subcellular+localization+in+rodents.">Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents.</a> J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).</li><li>Thaler, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+is+associated+with+hypothalamic+injury+in+rodents+and+humans.">Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).</li><li>Williams, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+dysfunction+in+obesity.">Hypothalamic dysfunction in obesity.</a> Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).</li><li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+phenotypic+array+of+hypothalamic+neuronal+cell+models+to+study+complex+neuroendocrine+disorders.">Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders.</a> Endocrinology. 145, 393-400 (2004).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay.">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li><li>Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin+A+decreases+lipid+peroxidation+and+apoptosis+in+a+novel+hypothalamic+cell+model.">Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model.</a> Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time,+dose+of+toxin,+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.+Assay+Drug+Dev.">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev.</a> Technol. 2, 51-62 (2004).</li><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening.">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).</li><li>Steffen, W., Linck, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunoblot:+a+sensitive+technique+to+stain+proteins+and+detect+multiple+antigens+on+a+single+two-dimensional+replica.">Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica.</a> Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).</li><li>Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+and+quantitation+of+proteins+on+western+blots+using+fluorescent+probes.">Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes.</a> Biotechniques. 29, 636-642 (2000).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time,+dose+of+toxin,+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).</li><li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+apoptosis:+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system.">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-650 (2002).</li><li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+pharmacological+manipulation+of+cell+death.">Caspases: pharmacological manipulation of cell death.</a> J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).</li></ol>

Multiplex analyse er et godt accepteret teknik, der er blevet brugt af forskere i talrige applikationer såsom PCR microarrays, immundetektion og andre protein-baserede metoder til påvisning 13, 14. For nylig har multiplexing assays blevet stadig mere anvendt i in vitro plade-baserede eksperimenter og er blevet valideret som en præcis metode til vurdering af cytotoksicitet og levedygtighed 12.. I ovenstående protokol, vi demonstrere effektiviteten af ​​multiplexing fluorescerende og...

Kost rig på mættede fedtsyrer, såsom palmitinsyre (PA) har været knyttet til fedme og andre følgesygdomme, herunder hjerte-kar-sygdomme og diabetes 1, 2. Højt fedtindhold har også vist sig at øge oxidativ stress, apoptose og neuronal degeneration i hypothalamus, en vigtig regulator af appetit og energiforbrug 3-7. Er derfor vigtig for udviklingen af ​​farmakologiske behandlinger for fedme Forstå den mekanisme, hvorigennem højt fedtindhold kost eksponering inducerer hypothalamus dysregulering. Men de cellulære mekanismer, hvorigennem fedt påvirker neuronal funktion er fortsat uklare. En bedre forståelse af, hvordan fedtstoffer, såsom PA kan udløse udbrud af hypothalamus apoptotiske veje er et nødvendigt første skridt hen imod dette mål. Målet med denne artikel er at beskrive en multiplex assay for in vitro-test af neuronal respons på PA eksponering, udviklet til brug i studier af hypothalamic neurodegeneration. Vi giver en detaljeret beskrivelse af en in vitro 96-brønds format multiplex assay til måling af caspase 3/7 aktivitet pr samlede antal celler i en differentieret udødeliggjort voksen mus hypothalamus cellelinje (betegnet A12) efter oxidativ udfordring med PA 8. Kort fortalt cellelevedygtighed bestemt efter PA udfordring via en resazurin assay. Resazurin er en celle-permeable forbindelse, der undergår enzymatisk reduktion af metabolisk aktive celler, en fremgangsmåde tænkt ske via mitokondrierne 9. Levedygtige celler kontinuerligt konvertere resazurin til resorufin, der producerer et fluorescerende signal proportionalt med antallet af levedygtige celler. Caspase-3/7 aktivitet analyseres derefter ved hjælp af en DEVD-baserede lumogenic assay. DEVD er en aminosyresekvens (Asp-Glu-Val-Asp) spaltes af caspase-3. Når denne sekvens er koblet til en lumogenic stof ved aktivering af intracellulær caspase-3/7 og efterfølgende spaltningaf DEVD substrat, det luminescerende produkt frigivet. Denne reaktion er proportional med caspaseaktivitet og dermed til induktion af apoptose. Da døde celler ikke kan producere caspase, caspase-3/7 aktivitet er af natur forbigående; analyse derfor skal udfyldes mellem 30 min til 4 timer efter udfordring, afhængigt af effektiviteten af ​​celle stressor. Cellelevedygtighed er omvendt proportional med caspase-3/7 aktivitet og kan anvendes til at bestemme mekanismer for celledød. For eksempel har denne metode tidligere blevet anvendt til at vise, at forbehandling med peptid hormon orexin nedsætter apoptose i hypothalamus celler udfordret med hydrogenperoxid, hvilket tyder på, at mekanismer, der er ramt af denne behandling er vigtige i at beskytte mod oxidativ skade 10. Det er vigtigt at bemærke disse assays er cellelinie-og vævs-afhængig, da de afhængige mitokondriel aktivitet at reducere assayreagenser. Denne protokol er optimeret til voksen mus hypothalamus (A12) celler; imidlertidbeskrevne fremgangsmåder kan ændres til at passe inden for rammerne af tilsvarende forskning. Multiplexing assays fra en enkelt kultur og giver en fordel i forhold til den traditionelle metode til udførelse af individuelle analyser af flere grunde. Ud over at spare tid, celleprøver og kultur reagenser kan multiplexing assays også give viden af cellernes overlevelse og død, giver den interne kontrol, og fjerne behovet for gentagne forsøg 11, 12. Alternative metoder har påberåbt Western blots eller ELISA&#39;er, som er pålidelige analyser, men er dyre og tidskrævende (1-2 dage), især ved anvendelse af en 96-brønds format. Fradrag af den tid, det tager at dyrke celler til multiplexing assay samlede tid er mindre end 3 timer. Mens dette protokol er blevet optimeret til brug med A12-celler, kan det ændres til brug i andre modeller samtidig huske faktorer, der kan påvirke celle integritet. Determinedrift Hvis denne protokol ville arbejde for en række forsøg, afhænger af antallet af prøver eller eksperimentelle betingelser, og om planlagte downstream eksperimenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Cellutions Biosystems Inc.</td>
			<td style="width:151px;">CLU172</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">10313-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:137px;">PAA Labs</td>
			<td style="width:151px;">A15-751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Palmitic Acid</td>
			<td style="width:137px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dimethy sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;"> 
			PrestoBlue Cell Viability Reagent</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Caspase-Glo 3/7 Assay Systems</td>
			<td style="width:137px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">G8091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Equipment</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:268px;">96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td>
			<td style="width:137px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model

Evnen til multiplex assays undersøgelser af komplekse cellulære mekanismer eliminerer behovet for gentagne eksperimenter giver interne kontroller, og mindsker spild omkostninger og reagenser. Her beskrives optimering af et multipleks assay til at vurdere apoptose efter en palmitinsyre (PA) udfordring i en in vitro hypothalamus model, ved hjælp af både fluorescerende og luminescerende assays til at måle levedygtige celletal og caspase-3/7 aktivitet i en 96-brønds mikrotiterpladeformat. Efter PA udfordring blev levedygtige celler bestemmes ved en resazurin-baserede fluorescerende assay. Caspase-3/7 aktivitet blev derefter bestemt ved hjælp af en luminogene substrat, DEVD og normaliseret til celle nummer. Denne multiplexing analyse er en nyttig teknik til at bestemme ændringer i caspaseaktivitet efter en apoptotisk stimulus, såsom mættet fedtsyre udfordring. Den mættede fedtsyre PA kan øge hypothalamus oxidativt stress og apoptose, der angiver den mulige indførselnce af assays, såsom den der er beskrevet her i at studere forholdet mellem mættede fedtsyrer og neuronal funktion.

Protokollen Ovenstående beskriver resultater i multiplexing to separate analyser for at fastslå mekanismer for celledød. Figur 1 viser en oversigt over protokollen til at bestemme cellernes levedygtighed og caspase-3/7 aktivitet. Caspaseaktivitet var signifikant forøget i celler udfordret med PA efter 2 timers inkubation (figur 2A og tabel 1). Tab af cellemembranens integritet er en morfologisk ændring der er associeret med induktion af apoptose, som er tydelig i c...

Watch this Scientific Journal Video about Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model at JoVE.com

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Multiplex analyser kan give gavnlig information for basale cellulære mekanismer og eliminere spild af reagenser og unødvendige gentagne eksperimenter. Vi beskriver her en multiplex caspase-3/7 aktivitet assay anvendelse af fluorescerende-og luminescerende-baserede metoder, for at bestemme cellelevedygtighed i en in vitro hypothalamus model efter oxidativ udfordring med palmitinsyre.

Anvendelse af en Caspase Multiplexing assay til bestemmelse af apoptose i en Hypothalamus Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Overvågning kløvet caspase-3 aktivitet og apoptose af udødeliggjort Oligodendroglial celler ved hjælp af Live-cell imaging og Cleaveable Fluorogenic-dye Substrater Efter Kalium-induceret membran depolarisering

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Funktionel Interrogation Adult Hypothalamus Neurogenese med Focal Radiological Hæmning

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

A Novel Light Damage Paradigm til Anvendelse i Retinal Regeneration Studies i Adult zebrafisk

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Mikroglia som et surrogat Biosensor til Bestem Nanopartikel Neurotoksicitet

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Brugen af Trace Eyeblink klassisk konditionering at vurdere hippocampus dysfunktion i en rotte Model af føtale alkohol spektrum forstyrrelser

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-celle måling af lugtstof Receptor aktivering ved hjælp af en Real-time lejr Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

A Protocol for Measuring Cue Reactivity in a Rat Model of Cocaine Use Disorder

En protokol til måling af Cue reaktivitet i en rotte Model af kokain brug lidelse

Cocaine use disorder (CUD) follows a trajectory of repetitive self-administration during which previously neutral stimuli gain incentive value. Cue ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

En Neurosphere analyse til at vurdere endogene neurale stamceller aktivering i en musemodel af Minimal rygmarvsskade

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...