Name: use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model at JoVE.com

Het hier beschreven onderzoek werd gefinancierd door het Amerikaanse Department of Veterans Affairs Biomedische Laboratorium Onderzoek en Ontwikkeling BX001686-1A1 en VA Revalidatie Onderzoek en Ontwikkeling.

1. Plating en onderhoud van Cultuur van de Cel <ol><li> Warm Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) cultuur media (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine / Neomycine) tot 37 ° C. </li><li> Verkrijgen voorraad van bevroren A12 cellen van -80 ° C. </li><li> Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad; eenmaal ontdooid, zachtjes pipet cellen over te dragen aan een 75 cm 2 geventileerde kolf en voeg 10 ml van de cultuur media. </li><li> Incubeer kolf overnacht in 5% CO 2 incubator bij 3...

<ol>
	<li>Akil, L., Ahmad, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+obesity+and+cardiovascular+diseases+in+four+southern+states+and+Colorado.">Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado.</a> J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).</li><li>Posey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+proinflammatory+lipid+accumulation,+inflammation,+and+insulin+resistance+in+rats+fed+a+high-fat+diet.">Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).</li><li>Moraes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet+induces+apoptosis+of+hypothalamic+neurons.">High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons.</a> PloS one. 4, (2009).</li><li>Mayer, C. M., Belsham, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+attenuates+insulin+signaling+and+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+apoptosis+in+hypothalamic+neurons:+rescue+of+resistance+and+apoptosis+through+adenosine+5'+monophosphate-activated+protein+kinase+activation.">Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation.</a> Endocrinology. 151, 576-585 (2010).</li><li>Benoit, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+acid+mediates+hypothalamic+insulin+resistance+by+altering+PKC-theta+subcellular+localization+in+rodents.">Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents.</a> J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).</li><li>Thaler, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+is+associated+with+hypothalamic+injury+in+rodents+and+humans.">Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).</li><li>Williams, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+dysfunction+in+obesity.">Hypothalamic dysfunction in obesity.</a> Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).</li><li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+phenotypic+array+of+hypothalamic+neuronal+cell+models+to+study+complex+neuroendocrine+disorders.">Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders.</a> Endocrinology. 145, 393-400 (2004).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay.">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li><li>Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin+A+decreases+lipid+peroxidation+and+apoptosis+in+a+novel+hypothalamic+cell+model.">Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model.</a> Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time,+dose+of+toxin,+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.+Assay+Drug+Dev.">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev.</a> Technol. 2, 51-62 (2004).</li><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening.">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).</li><li>Steffen, W., Linck, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunoblot:+a+sensitive+technique+to+stain+proteins+and+detect+multiple+antigens+on+a+single+two-dimensional+replica.">Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica.</a> Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).</li><li>Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+and+quantitation+of+proteins+on+western+blots+using+fluorescent+probes.">Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes.</a> Biotechniques. 29, 636-642 (2000).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time,+dose+of+toxin,+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).</li><li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+apoptosis:+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system.">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-650 (2002).</li><li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+pharmacological+manipulation+of+cell+death.">Caspases: pharmacological manipulation of cell death.</a> J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).</li></ol>

De multiplex test is een algemeen aanvaarde techniek die is gebruikt door wetenschappers in talrijke toepassingen zoals PCR microarrays, immunodetectie en andere op eiwit gebaseerde detectiemethoden 13, 14. Onlangs hebben multiplexing assays steeds gebruikt in in vitro-plaat gebaseerde experimenten en zijn gevalideerd als een nauwkeurige methode om de cytotoxiciteit en de levensvatbaarheid 12. In het bovenstaande protocol, we tonen de effectiviteit van multiplexing TL-en lichtgeve...

Diëten rijk aan verzadigde vetzuren zoals palmitinezuur (PA) zijn verbonden met obesitas en andere comorbiditeiten, waaronder cardiovasculaire ziekte en diabetes 1, 2. Vetrijke diëten hebben ook aangetoond dat oxidatieve stress, apoptose en neuronale degeneratie in de hypothalamus, een belangrijke regulator van de eetlust en het energieverbruik verhogen 3-7. Inzicht in het mechanisme waardoor blootstelling vetrijke dieet induceert hypothalamus ontregeling is dus belangrijk voor de ontwikkeling van farmacologische behandelingen voor zwaarlijvigheid. Echter, de cellulaire mechanismen waardoor vet in de voeding van invloed op neuronale functie blijven onduidelijk. Een beter begrip van hoe vetten zoals PA begin van de hypothalamus apoptoseroutes zou kunnen leiden is een noodzakelijke eerste stap in de richting van dit doel. Het doel van dit artikel is om een multiplex assay voor in vitro testen van neuronale respons op PA belichting, ontwikkeld voor gebruik in studies van h beschrijvenypothalamic neurodegeneratie. Wij geven een gedetailleerde beschrijving van een in vitro 96-well formaat multiplex assay voor het meten caspase 3/7 activiteit per totaal aantal cellen in een gedifferentieerde geïmmortaliseerde volwassen muis hypothalamus cellijn (aangeduid A12) na challenge met oxidatieve PA 8. In het kort wordt levensvatbaarheid van de cellen bepaald volgens PA uitdaging via een resazurin gebaseerde test. Resazurin is een cel permeabele stof die enzymatische reductie van metabool actieve cellen ondergaat, een werkwijze verondersteld op te treden via de mitochondriën 9. Levensvatbare cellen continu omzetten Resazurin te resorufine, produceren een fluorescent signaal evenredig met het aantal levensvatbare cellen. Caspase-3/7 Activiteit vervolgens geanalyseerd met een DEVD-gebaseerde lumogenic assay. DEVD is een aminozuursequentie (Asp-Glu-Val-Asp) gesplitst door caspase-3. Wanneer deze sequentie is gekoppeld met een lumogenic stof, na activatie van intracellulaire caspase-3/7 en daaropvolgende splitsingvan DEVD substraat, wordt het lichtgevende product uitgebracht. Deze reactie is evenredig met caspase activiteit en daarmee de inductie van apoptose. Dode cellen niet kan produceren caspase, caspase-3/7 activiteit is van nature van voorbijgaande aard; Daarom analyse moet verrichten tussen 30 minuten tot 4 uur na challenge, afhankelijk van de effectiviteit van de cel stressor. Cellevensvatbaarheid is omgekeerd evenredig met caspase-3/7 activiteit en kunnen worden gebruikt om mechanismen van celdood bepalen. Zo heeft deze methode eerder gebruikt dat voorbehandeling met het peptide hormoon orexin vermindert apoptose in hypothalamus cellen geprikkeld met waterstofperoxide, wat suggereert dat de mechanismen die door deze behandeling zijn belangrijk in het beschermen tegen oxidatieve beschadiging 10 te tonen. Het is belangrijk op te merken deze tests zijn cellijn-en weefsel-afhankelijke, als ze vertrouwen op mitochondriale activiteit assay reagentia verlagen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor volwassen muis hypothalamus (A12) cellen; echter,beschreven werkwijzen kunnen worden gewijzigd om te passen onder soortgelijk onderzoek. Multiplexing testen van een kweekputje biedt een voordeel boven de traditionele methode om afzonderlijke tests om verschillende redenen. Naast het besparen van tijd, celsteekproeven en cultuur reagentia, kan multiplexing assays ook kennis van de overleving van de cel en de dood, bieden interne controles, en elimineren de noodzaak voor herhaalde experimenten 11, 12. Alternatieve werkwijzen ingeroepen Western blots of ELISA&#39;s, waarvoor betrouwbare tests zijn, maar zijn duur en tijdrovend (1-2 dagen), vooral bij gebruik van een 96-putjes. Exclusief de tijd die het kost om de cultuur cellen voor de multiplexing-assay, de totale tijd is minder dan 3 uur. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met A12 cellen kunnen worden aangepast voor gebruik in andere modellen maar vergeet factoren die cel integriteit kunnen beïnvloeden. Afschrikkenmijnbouw of dit protocol zou werken voor een reeks experimenten afhankelijk van het aantal monsters en proefomstandigheden en geplande downstream experimenten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Cellutions Biosystems Inc.</td>
			<td style="width:151px;">CLU172</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">10313-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:137px;">PAA Labs</td>
			<td style="width:151px;">A15-751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Palmitic Acid</td>
			<td style="width:137px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dimethy sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;"> 
			PrestoBlue Cell Viability Reagent</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Caspase-Glo 3/7 Assay Systems</td>
			<td style="width:137px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">G8091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Equipment</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:268px;">96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td>
			<td style="width:137px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model

De mogelijkheid om multiplex assays in studies van complexe cellulaire mechanismen elimineert de noodzaak voor herhaalde experimenten, verschaft interne controles en vermindert afval kosten en reagentia. Hier beschrijven we optimalisatie van een multiplex assay apoptose beoordelen na een palmitinezuur (PA) uitdaging in een in vitro model hypothalamus, waarbij zowel fluorescerende en luminescerende gebaseerde bepalingen om levensvatbare cellen en caspase-3/7 te meten in een 96 putjes microtiterplaatformaat. Na PA uitdaging, werden levensvatbare cellen bepaald door een-resazurin gebaseerde fluorescentie. Caspase-3/7 activiteit werd vervolgens bepaald met een luminogenic substraat, DEVD en genormaliseerd naar het aantal cellen. Dit multiplexing test is een nuttige techniek voor het bepalen van veranderingen in caspase activiteit na een apoptotische stimulus, zoals verzadigde vetzuren uitdaging. De verzadigde vetzuren PA kan verhogen hypothalamus oxidatieve stress en apoptose, met vermelding van de mogelijke invoernce assays zoals beschreven hier bestuderen van verbanden tussen verzadigde vetzuren en neuronale functie.

Het protocol hierboven beschreven resultaten multiplexing twee assays mechanismen van celdood bepalen. Figuur 1 toont een overzicht van het protocol levensvatbaarheid van de cellen en caspase-3/7 activiteit te bepalen. Caspase activiteit significant verhoogd in cellen geprikkeld met PA na 2 uur incubatie (Figuur 2A en tabel 1). Verlies van celmembraanintegriteit een morfologische verandering geassocieerd met de inductie van apoptose, die zichtbaar is in cellen na 2 uur ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model at JoVE.com

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Multiplex testen kunnen nuttige informatie verschaffen voor basis cellulaire mechanismen en elimineren van verspilling van reagentia en onnodige herhaalde experimenten. We beschrijven hier een multiplex caspase-3/7 activiteit test, met fluorescerende-en-luminescente gebaseerde methoden, levensvatbaarheid van de cellen bepaald in een in vitro model hypothalamus na oxidatieve uitdaging palmitinezuur.

Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Optic Nerve transsectie: Een model van de volwassen Neuron Apoptosis in het centrale zenuwstelsel

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neurale-Colony Forming Cell-test: Een test om Bona Fide neurale stamcellen van Neural Progenitor Cellen Discrimineer

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Functionele Ondervraging van Adult hypothalamus Neurogenese met Focal Radiologische Remming

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

A Novel Lichte Schade Paradigm voor gebruik in retinale Regeneration Studies in Adult zebravis

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Microglia als een surrogaat Biosensor om te bepalen nanodeeltjes Neurotoxiciteit

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Het gebruik van Trace Eyeblink klassieke conditionering te beoordelen Hippocampal dysfunctie in een Rat Model van Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

A Protocol for Measuring Cue Reactivity in a Rat Model of Cocaine Use Disorder

Een Protocol voor het meten van Cue reactiviteit in een Rat Model van cocaïne gebruik wanorde

Cocaine use disorder (CUD) follows a trajectory of repetitive self-administration during which previously neutral stimuli gain incentive value. Cue ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...