Name: use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model at JoVE.com

Arbeidet som beskrives her ble finansiert av US Department of Veterans Affairs bioingeniører Forskning og Utvikling BX001686-1A1 og VA Rehabilitering Forskning og Utvikling.

En. Plating og vedlikehold av Cell Culture <ol><li> Varm Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kultur media (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / streptomycin / neomycin) til 37 ° C. </li><li> Skaffe lager av frosne A12 celler fra -80 ° C. </li><li> Raskt tine celler i 37 ° C vann-bad; Opptinte, forsiktig pipette celler til å overføre til en 75 cm 2 ventilert kultur kolbe og tilsett 10 ml kulturmedier. </li><li> Inkuber kolbe over natten i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Sug media etter 24 timer ...

<ol>
	<li>Akil, L., Ahmad, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+obesity+and+cardiovascular+diseases+in+four+southern+states+and+Colorado.">Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado.</a> J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).</li><li>Posey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+proinflammatory+lipid+accumulation,+inflammation,+and+insulin+resistance+in+rats+fed+a+high-fat+diet.">Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).</li><li>Moraes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet+induces+apoptosis+of+hypothalamic+neurons.">High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons.</a> PloS one. 4, (2009).</li><li>Mayer, C. M., Belsham, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+attenuates+insulin+signaling+and+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+apoptosis+in+hypothalamic+neurons:+rescue+of+resistance+and+apoptosis+through+adenosine+5'+monophosphate-activated+protein+kinase+activation.">Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation.</a> Endocrinology. 151, 576-585 (2010).</li><li>Benoit, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+acid+mediates+hypothalamic+insulin+resistance+by+altering+PKC-theta+subcellular+localization+in+rodents.">Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents.</a> J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).</li><li>Thaler, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+is+associated+with+hypothalamic+injury+in+rodents+and+humans.">Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).</li><li>Williams, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+dysfunction+in+obesity.">Hypothalamic dysfunction in obesity.</a> Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).</li><li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+phenotypic+array+of+hypothalamic+neuronal+cell+models+to+study+complex+neuroendocrine+disorders.">Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders.</a> Endocrinology. 145, 393-400 (2004).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay.">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li><li>Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin+A+decreases+lipid+peroxidation+and+apoptosis+in+a+novel+hypothalamic+cell+model.">Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model.</a> Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time,+dose+of+toxin,+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.+Assay+Drug+Dev.">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev.</a> Technol. 2, 51-62 (2004).</li><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening.">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).</li><li>Steffen, W., Linck, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunoblot:+a+sensitive+technique+to+stain+proteins+and+detect+multiple+antigens+on+a+single+two-dimensional+replica.">Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica.</a> Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).</li><li>Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+and+quantitation+of+proteins+on+western+blots+using+fluorescent+probes.">Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes.</a> Biotechniques. 29, 636-642 (2000).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time,+dose+of+toxin,+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).</li><li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+apoptosis:+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system.">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-650 (2002).</li><li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+pharmacological+manipulation+of+cell+death.">Caspases: pharmacological manipulation of cell death.</a> J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).</li></ol>

Den multiplex-analysen er et godt akseptert teknikk som har blitt brukt av forskere i en rekke applikasjoner som PCR-mikromatriser, immunodeteksjonsprosedyren og andre protein-baserte deteksjonsmetoder 13, 14. Nylig har multipleksing analyser blitt stadig mer brukt i in vitro-plate-baserte forsøk og har blitt validert som en nøyaktig metode for å vurdere cytotoksisitet og levedyktighet 12. I den ovennevnte protokoll har vi demonstrere effektiviteten av multipleksing fluorescere...

Diett rik på mettede fettsyrer, slik som palmitin-syre (PA) har vært knyttet til fedme og andre samtidige sykdommer, inkludert kardiovaskulær sykdom og diabetes 1, 2. Høyt fettinntak har også blitt vist å øke oksidativt stress, apoptose og neuronal degenerasjon i hypothalamus, en viktig regulator av appetitt og energiforbruk 3-7. Forstå mekanisme som fettrik diett eksponering induserer hypothalamus feilregulering er derfor viktig for utvikling av farmakologisk behandling for fedme. Men de cellulære mekanismene som fett påvirker nervecellefunksjon fortsatt uklare. En bedre forståelse av hvordan fett som PA kan utløse utbruddet av hypothalamus apoptotic trasé er et nødvendig første skritt mot dette målet. Målet med denne artikkelen er å beskrive en multipleks assay for in vitro testing av neuronal respons til eksponering PA, utviklet for bruk i studier av hypothalamic neurodegeneration. Vi gir en detaljert beskrivelse av en in vitro 96-brønners format multipleks-analyse for måling av caspase 3/7-aktivitet pr totalt antall celler i en differensiert udødelig voksen mus hypothalamus cellelinje (betegnet A12) etter oksydativ utfordring med PA 8.. I korthet blir cellenes levedyktighet bestemt etter utfordring PA via en resazurin baserte assay. Resazurin er en celle gjennomtrengelig stoff som gjennomgår enzymatisk reduksjon i metabolsk aktive celler, en fremgangsmåte tenkt skje via mitokondriene 9.. Levedyktige celler kontinuerlig konvertere resazurin til resorufin, som produserer et fluorescerende signal proporsjonal med antallet levedyktige celler. Caspase-3/7-aktivitet blir deretter analysert ved hjelp av en DEVD-baserte lumogenic assay. DEVD er en aminosyre-sekvens (Asp-Glu-Val-Asp) spaltes av caspase-3. Når denne sekvens er koplet til en lumogenic substans, ved aktivering av intracellulære caspase-3/7 og etterfølgende spaltingav DEVD substrat, blir luminescerende produktet frigjøres. Denne reaksjon er proporsjonal med kaspase-aktivitet og dermed til induksjon av apoptose. Som døde celler ikke kan produsere caspase, er caspase-3/7 aktivitets av natur forbigående; Derfor analyse bør fullføres mellom 30 min til 4 timer post-utfordring, avhengig av effektiviteten til cellen stressfaktor. Celleviabilitet er omvendt proporsjonal med caspase-3/7-aktivitet og kan brukes til å bestemme mekanismene for celledød. For eksempel har denne metoden tidligere blitt brukt til å vise at forbehandling med peptid-hormonet orexin reduserer apoptose i hypothalamus-celler utfordret med hydrogenperoksid, noe som tyder på at mekanismer som påvirkes av denne behandling er viktig for å beskytte mot oksydativ skade 10. Det er viktig å være oppmerksom på disse analysene er cellelinje-og vev-avhengig, slik at de er avhengige av mitokondriell aktivitet for å redusere analysereagensene. Denne protokollen er optimalisert for voksen mus hypothalamus (A12) celler; Menmetoder som er beskrevet kan bli endret for å passe innenfor omfanget av lignende undersøkelser. Multiplexing assays fra en enkelt kultur vel gir en fordel i forhold til den tradisjonelle metode for å utføre individuelle analyser av flere grunner. I tillegg til å spare tid, celleprøver, og kultur reagenser, kan multipleksing assays også gi kunnskap om celle overlevelse og død, gir intern kontroll, og eliminerer behovet for gjentatte forsøk 11, 12. Alternative metoder har stolt på Western-blots eller ELISAs, som er pålitelige analyser, men er kostbare og tidkrevende (1-2 dager), spesielt ved bruk av en 96-brønns format. Unntatt den tiden det tar for å dyrke celler for multipleksing analysen, er den totale tid som er mindre enn 3 timer. Mens denne protokollen er optimalisert for bruk med A12 celler, kan det bli endret for bruk i andre modeller, men husk samtidig faktorer som kan påvirke celle integritet. Avskrekkegruvedrift hvis denne protokollen vil fungere for en serie eksperimenter er avhengig av antallet prøver eller eksperimentelle betingelser og på nedstrøms planlagte eksperimenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Cellutions Biosystems Inc.</td>
			<td style="width:151px;">CLU172</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">10313-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:137px;">PAA Labs</td>
			<td style="width:151px;">A15-751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Palmitic Acid</td>
			<td style="width:137px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dimethy sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;"> 
			PrestoBlue Cell Viability Reagent</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Caspase-Glo 3/7 Assay Systems</td>
			<td style="width:137px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">G8091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Equipment</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:268px;">96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td>
			<td style="width:137px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model

Evnen til å multiplekse assays i studier av komplekse cellulære mekanismer eliminerer behovet for gjentatte forsøk, gir intern kontroll, og reduserer avfall i kostnader og reagenser. Her beskriver vi optimalisering av en multipleks-analyse for å vurdere apoptose etter en palmitinsyre (PA) felling i en in vitro modell hypothalamus, ved bruk av både fluorescerende og luminescerende baserte analyser for å måle levedyktige celletall og kaspase-3/7 aktivitet i en 96-brønns mikrotiter-plate-format. Etter PA utfordring, ble levedyktige celler bestemt ved en resazurin baserte fluorescerende assay. Caspase-3/7-aktivitet ble deretter bestemt ved hjelp av en luminogenic substrat, DEVD og normalisert til cellenummer. Denne multipleksing undersøkelsen er en nyttig teknikk for å bestemme endringen i kaspase-aktivitet etter en apoptotisk stimulus, så som mettede fettsyrer utfordring. Den mettede fettsyre PA kan øke hypothalamus oksidativt stress og apoptose, som indikerer den potensielle importance av metoder slik som den som er beskrevet her i å studere forholdet mellom mettede fettsyrer og neuronal funksjon.

Protokollen ovenfor beskriver resultatene i multipleksing to separate analyser for å bestemme mekanismene for celledød. Figur 1 viser en oversikt over den protokoll for å bestemme cellenes levedyktighet og kaspase-3/7-aktivitet. Caspase-aktivitet ble signifikant økt i cellene utfordret med PA etter 2 timers inkubasjon (figur 2A og tabell 1). Tap av cellemembranintegritet er en morfologisk endring assosiert med induksjon av apoptose, som er tydelig i celler etter 2 t...

Watch this Scientific Journal Video about Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model at JoVE.com

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Multiplex analyser kan gi nyttige opplysninger for grunnleggende cellulære mekanismene og eliminere sløsing av reagenser og unødvendige gjentatte eksperimenter. Vi beskriver her en multipleks caspase-3/7 aktivitetsanalyse, ved hjelp av fluorescerende og luminescerende-baserte metoder for å bestemme celle-levedyktighet i en in vitro modell hypothalamus følgende oksidativ utfordring med palmitinsyre.

Anvendelse av en Caspase Multiplexing-analysen fastslår apoptose i en celle hypothalamus Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Overvåking kløyvde caspase-3 Aktivitet og Apoptose av udødeliggjort Oligodendroglial Cells bruker Live-cell Imaging og Cleaveable Fluorogenic-dye Underlag Etter Kalium-indusert Membrane depolarisering

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Funksjonell Avhør av Adult Hypothalamus Neurogenesis med Focal Radiologisk Hemming

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

A Novel Lett Skade Paradigm for bruk i Retinal Regeneration Studies in Adult sebrafisk

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Microglia som et surrogat Biosensor fastslår partikler Nevro

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Bruk av spor Eyeblink klassisk betinging å vurdere hippocampus dysfunksjon i en rotte modell av Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-celle måling av Odorant reseptor aktivisering benytter en sanntid leiren analysen

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

A Protocol for Measuring Cue Reactivity in a Rat Model of Cocaine Use Disorder

En protokoll for å måle Cue reaktivitet i en rotte modell av kokain bruk lidelse

Cocaine use disorder (CUD) follows a trajectory of repetitive self-administration during which previously neutral stimuli gain incentive value. Cue ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

En Neurosphere analysen vurdere endogene nevrale stamceller aktivering i en musemodell av Minimal ryggmargsskade

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...