Name: use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00
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O trabalho aqui descrito foi financiado pelo Departamento de Assuntos de Veteranos EUA Biomédica Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento BX001686-1A1 e VA Reabilitação de Investigação e Desenvolvimento.

1. Chapeamento e manutenção da cultura celular <ol><li> Quente de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) meio de cultura (DMEM + 10% FBS + 1% de Penicilina / Estreptomicina / Neomicina) a 37 ° C. </li><li> Obter estoque da A12 células congeladas de -80 ° C. </li><li> Descongelar rapidamente células em 37 ° C num banho de água; uma vez descongelado, suavemente as células de pipeta para transferir para um frasco de cultura ventilada 75 centímetros 2 e adicione 10 ml de meio de cultura. </li><li> Inc...

<ol>
	<li>Akil, L., Ahmad, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+obesity+and+cardiovascular+diseases+in+four+southern+states+and+Colorado.">Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado.</a> J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).</li><li>Posey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+proinflammatory+lipid+accumulation,+inflammation,+and+insulin+resistance+in+rats+fed+a+high-fat+diet.">Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).</li><li>Moraes, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+dysfunction+in+obesity.">Hypothalamic dysfunction in obesity.</a> Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).</li><li>Belsham, D. 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R., Nguyen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+and+quantitation+of+proteins+on+western+blots+using+fluorescent+probes.">Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes.</a> Biotechniques. 29, 636-642 (2000).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time,+dose+of+toxin,+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).</li><li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+apoptosis:+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system.">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-650 (2002).</li><li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+pharmacological+manipulation+of+cell+death.">Caspases: pharmacological manipulation of cell death.</a> J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).</li></ol>

O ensaio multiplex é uma técnica bem aceite que tem sido utilizado por cientistas em numerosas aplicações tais como PCR, microarrays de imunodetecção, e outros métodos de detecção baseados em proteínas de 13, 14. Recentemente, ensaios de multiplexagem tornaram-se cada vez mais utilizado em experiências in vitro, baseados em placa e foram validados como um método acurado para avaliar a citotoxicidade e viabilidade 12. No protocolo anterior, que demonstram a eficácia de lâmpada...

Dietas ricas em ácidos graxos saturados, como o ácido palmítico (PA) têm sido associados a obesidade e outras comorbidades, como doenças cardiovasculares e diabetes 1, 2. Dietas ricas em gordura também foram mostrados para aumentar o estresse oxidativo, apoptose e degeneração neuronal no hipotálamo, um importante regulador do apetite e gasto energético 3-7. Compreender o mecanismo através do qual a exposição dieta rica em gordura induz desregulação hipotalâmica é, portanto, importante para o desenvolvimento de tratamentos farmacológicos para a obesidade. No entanto, os mecanismos celulares pelos quais a gordura na dieta afeta a função neuronal permanecem obscuros. Uma melhor compreensão de como gorduras, como PA pode desencadear o início de vias apoptóticas hipotálamo é um primeiro passo necessário em direção a esse objetivo. O objetivo deste artigo é descrever um ensaio multiplex para testes in vitro de resposta neuronal à exposição PA, desenvolvido para uso em estudos de hneurodegeneração ypothalamic. Fornecemos uma descrição detalhada de um formato de 96 poços de ensaio multiplex in vitro para medir a caspase 3/7 actividade por número total de células de uma linha imortalizada diferenciadas célula hipotalâmica do rato adulto (designado A12) após o desafio oxidativo com PA 8. Resumidamente, a viabilidade celular é determinada após o desafio com PA através de um ensaio baseado resazurina. Resazurina é um composto permeável célula que sofre redução enzimática em células metabolicamente activas, um processo que se pensa ocorrer por meio da mitocôndria 9. As células viáveis ​​converter continuamente resazurina a resorufina, a produção de um sinal fluorescente proporcional à quantidade de células viáveis. Actividade da caspase-3/7 é então analisado utilizando um ensaio baseado lumogenic-DEVD. DEVD é uma sequência de aminoácidos (Asp-Glu-Val-Asp) clivada pela caspase-3. Quando esta sequência é acoplado a uma substância lumogenic, aquando da activação intracelular de caspase-3/7 e subsequente clivagemde substrato DEVD, o produto luminescente é liberada. Esta reacção é proporcional à actividade da caspase e, consequentemente, para a indução de apoptose. Como as células mortas não podem produzir caspase, caspase-3/7 atividade é de natureza transitória; portanto, a análise deve ser concluída entre 30 minutos a 4 horas após o desafio, dependendo da eficácia do estressor celular. A viabilidade das células é inversamente proporcional à actividade da caspase-3/7 e pode ser usado para determinar os mecanismos de morte celular. Por exemplo, este método tem sido utilizado para demonstrar que o pré-tratamento com a hormona peptídica orexina reduz a apoptose em células do hipotálamo desafiados com peróxido de hidrogénio, o que sugere que os mecanismos afectadas por este tratamento são importantes para a protecção contra danos oxidativos 10. É importante notar estes ensaios são linha e células dependente de tecido, uma vez que dependem de actividade mitocondrial para reduzir os reagentes do ensaio. Este protocolo foi otimizado para rato adulto hipotálamo (A12) células; no entanto,métodos descritos podem ser alterados para se ajustar dentro do âmbito da investigação semelhante. Os ensaios de multiplexação de um único poço de cultura proporciona uma vantagem em relação ao método tradicional de realização de ensaios individuais para várias razões. Além da economia de tempo, amostras de células, e os reagentes de cultura, ensaios de multiplexação também pode proporcionar conhecimentos sobre a sobrevivência das células e a morte, fornecem controlos internos, e eliminar a necessidade de experiências repetidas 11, 12. Métodos alternativos têm invocado borrões ou ELISAs ocidentais, que são ensaios de confiança, mas é dispendioso e consome tempo (1-2 dias), especialmente quando se utiliza um formato de 96 poços. Excluindo o tempo que leva para as células de cultura para o ensaio de multiplexagem, o tempo total é menos do que 3 horas. Embora este protocolo foi optimizado para utilização com células A12, pode ser alterada para uso em outros modelos, mantendo em mente os fatores que podem influenciar a integridade celular. Determineração se este protocolo iria trabalhar para uma série de experimentos depende do número de amostras ou condições experimentais e em experimentos a jusante planejadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Cellutions Biosystems Inc.</td>
			<td style="width:151px;">CLU172</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">10313-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:137px;">PAA Labs</td>
			<td style="width:151px;">A15-751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Palmitic Acid</td>
			<td style="width:137px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dimethy sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:137px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;"> 
			PrestoBlue Cell Viability Reagent</td>
			<td style="width:137px;">Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Caspase-Glo 3/7 Assay Systems</td>
			<td style="width:137px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">G8091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Equipment</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:268px;">96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile</td>
			<td style="width:137px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td>
			<td style="width:137px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model

A capacidade de multiplexar os ensaios em estudos de mecanismos celulares complexas elimina a necessidade de experiências repetitivas, fornece os controlos internos, e diminui os custos e desperdícios de reagentes. Aqui descrevemos optimização de um ensaio multiplex para avaliar a apoptose após um ácido palmítico (PA) desafio em um modelo in vitro do hipotálamo, usando tanto fluorescentes e luminescentes baseados ensaios para medir a contagem de células viáveis ​​e caspase-3/7 em actividade de 96 poços formato de placa de microtitulação. A seguir ao desafio PA, as células viáveis ​​foram determinados por um ensaio fluorescente baseado em resazurina. A caspase-3/7 actividade foi determinada usando um substrato luminogenic, DEVD, e normalizada para o número de células, em seguida. Este ensaio de multiplexação é uma técnica útil para determinar as alterações na actividade da caspase após o estímulo por apoptose, tais como desafio ácido gordo saturado. O ácido gordo saturado PA pode aumentar o stress oxidativo e apoptose hipotalâmico, indicando o potencial importance de ensaios tais como os descritos aqui em estudar a relação entre os ácidos gordos saturados e função neuronal.

O protocolo acima descreve resultados na multiplexação de dois ensaios separados para determinar os mecanismos de morte celular. Figura 1 mostra uma visão geral do protocolo para determinar a viabilidade celular e caspase-3/7 atividade. Actividade de caspase foi significativamente aumentada em células desafiadas com PA após 2 horas de incubação (Figura 2A e na Tabela 1). A perda da integridade da membrana celular é uma alteração morfológica associada com a in...

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Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Ensaios Multiplex pode fornecer informações úteis para os mecanismos celulares básicos e eliminar o desperdício de reagentes e experiências repetitivas desnecessárias. Descrevemos aqui um ensaio multiplex atividade caspase-3/7, usando métodos fluorescentes e luminescentes à base, para determinar a viabilidade celular em um modelo in vitro hipotálamo seguinte desafio oxidativo com ácido palmítico.

Utilização de uma caspase Multiplexing ensaio para determinar a apoptose em um modelo de célula hipotalâmica

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Neurociência

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Monitoramento de Atividades de caspase-3 Clivadas e apoptose das células oligodendrogliais Imortalizado usando Live-célula Imaging and Cleaveable Fluorogênico-dye seguintes substratos de potássio induzida por despolarização da membrana

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

A Light Novel danos Paradigma para uso em estudos de regeneração da retina em Zebrafish Adulto

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Microglia como um Biosensor Surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

O uso do condicionamento de rastreamento Eyeblink clássico para avaliar disfunção Hippocampal em um modelo do rato de transtornos do espectro do álcool Fetal

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

A Protocol for Measuring Cue Reactivity in a Rat Model of Cocaine Use Disorder

Um protocolo para medição de reatividade de Cue em um modelo do rato do transtorno de uso de cocaína

Cocaine use disorder (CUD) follows a trajectory of repetitive self-administration during which previously neutral stimuli gain incentive value. Cue ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...