Name: a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01-GM-098977-R21 وAI-098122 لبنك الكويت المركزي وKEG. وأيد RSS في جزء من زمالة مؤسسة لوسي وجزئيا على زمالة برنامج الابتكار ثاير ثاير من كلية الهندسة.

تضم أربعة أنشطة رئيسية مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II: 1 التجليد: الببتيدات اختبار تتنافس مع الببتيدات السيطرة مرقوم للمرحلة حل ملزم للذوبان البروتينات MHC II. ملزمة يقاس على مدى واسع من تركيزات الببتيد الاختبار. 2-الالتقاط: بعد اقتراب رد فعل ملزم التوازن، يتم التقاطها الببتي...

<ol>
	<li>Steere, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-refractory+Lyme+arthritis+is+associated+with+HLA-DR+molecules+that+bind+a+Borrelia+burgdorferi+peptide.">Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide.</a> J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).</li><li>Raddrizzani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+peptide+interaction+enable+HLA-DQ+and+HLA-DR+molecules+to+bind+diverse+peptide+repertoires.">Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires.</a> J. Immunol. 159, 703-711 (1997).</li><li>Osipovitch, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+immune-evading+enzymes+for+ADEPT+therapy.">Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy.</a> Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).</li><li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico-accelerated+identification+of+conserved+and+immunogenic+variola/vaccinia+T-cell+epitopes.">In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes.</a> Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).</li><li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+HLA+DR+epitope+de-immunization+of+Factor+VIII+in+vitro+and+in+vivo.">Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo.</a> Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).</li><li>Aggarwal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+fueling+the+biotech+engine-2011+to+2012.">What's fueling the biotech engine-2011 to 2012.</a> Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Warmerdam, P. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+a+human+T-cell+region+in+staphylokinase+by+T-cell+screening+and+computer+modeling.">Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling.</a> Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).</li><li>Jones, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+removal+of+a+promiscuous+CD4+T+cell+epitope+from+the+C1+domain+of+factor+VIII.">Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII.</a> J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).</li><li>Harding, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beta-lactamase+with+reduced+immunogenicity+for+the+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+using+antibody-directed+enzyme+prodrug+therapy.">A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy.</a> Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).</li><li>Mazor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+elimination+of+an+immunodominant+T-cell+epitope+in+recombinant+immunotoxins+based+on+Pseudomonas+exotoxin+A.">Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).</li><li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+enzyme+deimmunization+by+combinatorial+T-cell+epitope+removal+using+neutral+drift.">Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).</li><li>Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Ag-specific+immune+responses:+understanding+immunopathogenesis+and+improving+diagnostics+in+infectious+disease,+autoimmunity+and+cancer.">Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer.</a> Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).</li><li>Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+T+epitope+mapping+and+vaccine+development.">High throughput T epitope mapping and vaccine development.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).</li><li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry.">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li><li>Singh, H., Raghava, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProPred:+prediction+of+HLA-DR+binding+sites.">ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.</a> Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).</li><li>Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCPred:+bringing+a+quantitative+dimension+to+the+online+prediction+of+MHC+binding.">MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding.</a> Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).</li><li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SVRMHC+prediction+server+for+MHC-binding+peptides.">SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides.</a> BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).</li><li>Bui, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+generation+and+evaluation+of+specific+MHC+binding+predictive+tools:+ARB+matrix+applications.">Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications.</a> Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).</li><li>Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+MHC+class+II+binding+affinity+using+SMM-align,+a+novel+stabilization+matrix+alignment+method.">Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method.</a> BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).</li><li>Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCIIpan-2.0+-+Improved+pan-specific+HLA-DR+predictions+using+a+novel+concurrent+alignment+and+weight+optimization+training+procedure.">NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure.</a> Immun. Res. 6, 9 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De-immunization+of+therapeutic+proteins+by+T-cell+epitope+modification.">De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification.</a> Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).</li><li>Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+redesign+of+proteins+for+minimal+T-cell+epitope+content.">Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content.</a> J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).</li><li>Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins.</a> J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).</li><li>Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+therapeutic+proteins+to+delete+T-cell+epitopes+while+maintaining+beneficial+residue+interactions.">Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions.</a> J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).</li><li>Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+algorithms+for+functional+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins.</a> BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+risk,+improving+outcomes:+Bioengineering+less+immunogenic+protein+therapeutics.">Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics.</a> Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+assessment+of+MHC+class+II+peptide+binding+predictions+and+evaluation+of+a+consensus+approach.">A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).</li><li>Sette, A., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+vaccinology:+developing+vaccines+in+the+era+of+genomics.">Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics.</a> Immunity. 33, 530-541 (2010).</li><li>Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines.">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li><li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices.">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales.">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636 (2012).</li><li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics:+a+decade+of+reverse+vaccinology.">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li><li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC.">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li><li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays.">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li></ol>

وقد أنشأت Biotherapeutics نفسها باعتبارها حجر الزاوية في الطب الحديث، وهو ما يمثل أربعة من الخمسة الاوائل الأدوية مبيعا في عام 2012 32. وقد أظهرت قطاع الصيدلانيات البيولوجية النمو المطرد لعدة سنوات 6، والتطوير المستمر للعوامل الرواية فضلا عن ظهور البدائل الحيوية و...

البروتينات هي أسرع فئة متزايدة من العوامل العلاجية 6، وركزت التوسع السريع في خطوط الأنابيب biotherapeutic باهتمام متزايد على التحديات المرتبطة بالتنمية واستخدام العقاقير البروتين. ينبع اعتبار واحد فريد من نوعه من حقيقة أنه، في نظام المناعة الصحي والعمل، يتم أخذ عينات جميع البروتينات خارج الخلية بواسطة مستضد تقديم الخلايا (ناقلات الجنود المدرعة). مرة واحدة المنضوية بواسطة ناقلات الجنود المدرعة، والمشقوق بروتين الببتيد إلى شظايا صغيرة، ويتم تحميل شرائح المناعية المفترضة في أخدود من الدرجة الثانية البروتينات التوافق النسيجي الرئيسي المعقدة (MHC II). ثم يتم عرض المجمعات الببتيد-MHC II على سطح APC، والببتيدات مناعة حقيقية، ووصف خميس الحواتم الخلايا، وشكل الثلاثي MHC II-الببتيد-T المجمعات مستقبلات الخلايا CD4 T مع المشابهة مستقبلات سطح الخلية 7. هذا الحدث الاعتراف الجزيئية الحرجة يبدأ سلسلة معقدة إشارات، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا T، والإفراج عن خلوىق، CD4 T-B بوساطة خلية خلية النضج، وفي نهاية المطاف إنتاج الأجسام المضادة المنتشرة التي تربط مفتش لمسح والخارجية البروتين المتسبب في المشكلة. وبالتالي، قد يكون deimmunized البروتينات المناعية عن طريق تحديد التأسيسية الحواتم الخلايا التائية وتحور بقايا الرئيسية المسؤولة عن تشكيل MHC II معقدة. مشيرا إلى أنها تتحمل، مع ذلك، أن خميس الحواتم الخلية يمكن أن تكون عديدة وعلى نطاق واسع في جميع أنحاء توزيع البروتينات المناعية، والغالبية العظمى من الطفرات حذف حاتمة من المحتمل أن يسبب خسائر غير مقصودة من وظيفة البروتين أو الاستقرار. وبالتالي، يمكن deimmunized الهندسة biotherapies أن يكون هدفا معقدة وصعبة من الناحية الفنية، ولكن توجد العديد من الأمثلة الناجحة T حاتمة خلية المشاريع الحذف 3،5،8-12. على عكس القائمة على تطعيم &quot;أنسنة&quot;، الذي يقتصر إلى حد كبير إلى العلاجات الضد، حاتمة الحذف يمكن تطبيقها على أي هدف أساسا من البروتين بغض النظر عن تسلسل، وهيكل، وظيفة، أو توافر homologoلنا السقالات الإنسان. الخطوة الأولى لتنفيذ هذا النهج هو تحديد الحواتم الببتيد الرئيسية جزءا لا يتجزأ من داخل تسلسل البروتين الهدف. يمكن عالية الإنتاجية فحوصات البيوكيميائية باستخدام الببتيدات الاصطناعية والمؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم رؤى الأولية السريعة في تحديد حاتمة والتخفيف 1،3-5. ويمكن لهذه المقايسات نوع ELISA يكون مكملا قويا لغيرها من تصميم وتطوير الأدوات البروتين / قاح. على سبيل المثال، واحدة المنهج التجريبي راسخة لرسم خرائط حاتمة يعتمد على الوقت، والعمل، والموارد فيفو السابقين المقايسات تكاثر الخلايا المركزة 15. لفترة وجيزة، وينقسم التسلسل الرئيسي للبروتين الهدف الأول في لوحة من الببتيدات متداخلة، وغالبا 15 السائدة مع 12 بقايا تتداخل بين الببتيدات المجاورة. يتم تصنيعه كيميائيا لوحة الببتيد ويتم اختبار المناعية لكل الببتيد في واحدة من عدة المناعية المختلفة التي توظف bloo الطرفيةالخلايا وحيدة النواة د (PBMC) المعزولة من المانحين الإنسان 13،14. لتوفير قدر أكبر من الثقة في النتائج، يتم اختبار الببتيدات عادة في تكرار مع PBMC من 50 أو أكثر الجهات المانحة المختلفة. في الحالات التي يكون فيها deimmunization هو الهدف النهائي، وتتفاقم الأعمال الأخرى بسبب الحاجة لإنتاج لوحات إضافية من الببتيدات تحور واختبار الألواح الببتيد الجديدة في المقايسات PBMC قبل إدخال أي طفرات في بروتين deimmunizing طول الكامل للتحليل وظيفي لاحقة 10. في حين لا تزال هذه المقايسات الخلوية المعيار الذهبي لتقييم إمكانات المناعية في المرضى من البشر، يمكن تحسين كفاءة هذا النهج شاملة من قبل prefiltering الحواتم المناعية المفترضة باستخدام الإنتاجية السريعة وعالية MHC II-الببتيد مقايسة ملزمة. وبالمثل، والكيمياء الحيوية المقايسات ملزمة الببتيد-MHC II يمكن دمجها مع التنبؤية في أساليب سيليكون لتسريع جذري في عملية تحديد الهوية حاتمة.توجد مجموعة متنوعة من الأدوات الحسابية لحاتمة تي خلية التنبؤ، وتشمل الأمثلة ProPred 16، MHCPred 17، SVRMHC 18، ARB 19، SMM محاذاة 20، 21 NetMHCIIpan فضلا عن أدوات الملكية مثل EpiMatrix بواسطة EpiVax 22. وبالمثل، تم مؤخرا جنبا إلى جنب مع تنبؤ حاتمة المعلوماتية الحيوية الأخرى، وأدوات النمذجة الجزيئية لانتاج خوارزميات deimmunization البروتين متكاملة تهدف للحد من المخاطر التي قد الطفرات deimmunizing تعطيل بنية البروتين وظيفة 23-26. في حين أثبتت عدة تنبئ حاتمة أن تكون دقيقة إلى حد معقول 27،28، النتائج الحسابية تتطلب دائما التحقق التجريبي. السريع، وإنتاجية عالية، وفعالة من حيث التكلفة الطرق التجريبية هي الأنسب كعامل تصفية أولية للسيليكون في التنبؤات حاتمة. في سياق مماثل، يمكن أن تنبئ حاتمة مستضد لاختيار قيادة vaccinolo العكسيغراي 29،30. على سبيل المثال، قد أسفرت عن التقدم في المعلوماتية الحيوية شاشات الجينوم التي تحدد بسرعة اللقاحات المرشحة في شكل البروتينات كليا أو الحواتم الببتيد المستخرجة من proteomes الممرض. بينما هذه التكنولوجيا تمكن هو إعادة تشكيل اكتشاف وتطوير لقاحات واقية، فإنه يدخل تحديا جديدا في شكل قوائم كبيرة intractably المرشحين لقاح مناعة. يمكن المقايسات ملزمة عالية الإنتاجية الببتيد-MHC II توجيه اختيار حاتمة عن طريق قياس الببتيد تقارب ملزمة ملزمة والمجون بين الأليلات متعددة MHC II. كما هو الحال مع البروتين deimmunization، فإن المطلوب من هذه الطرق التجريبية في نهاية المطاف للتحقق من صحة التنبؤات الحسابية يؤدي لقاح واعد. هنا، يوصف مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II تحجيمها إلى تنسيق 384 جيدا. البروتوكول هو متوازية إلى حد كبير ويقلل من التكاليف بنسبة 75٪ كاشف مقارنة موضح سابقا 96 لوحة جيدا صيغ 1،3-5. باستخدام LIQUI واحدد التعامل مع الروبوت، وهذا الأسلوب يسمح أحد الباحثين لتحليل ما يقرب من تسعين الببتيدات بسهولة اختبار في ثلاث نسخ على مجموعة من ثمانية تجمعات وأربعة أنواع أليل MHC الثاني في أقل من 48 ساعة. توضح هذه المقالة الإعداد من لوحة واحدة 384 جيدا لتحليل ELISA سبعة الببتيدات التجريبية ضد أحد MHC II الأليل، ولكن يتم توفير الآلات الحاسبة ورقة انتشرت كمادة تكميلية بحيث يسهل على مقياس التجربة إلى أي عدد من الببتيدات المطلوب و / أو MHC الثاني الجزيئات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

يمكن فحوصات البيوكيميائية مع المؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم سريع، رؤى الكمي في تحديد حاتمة المناعية، الحذف، أو تصميم 1،2. هنا، يتم تحجيم مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II إلى تنسيق 384 جيدا. بروتوكول تقليص يقلل التكاليف بنسبة 75٪ كاشف والإنتاجية أعلى من البروتوكولات التي سبق وصفها جيدا 1،3-5 96. على وجه التحديد، والتصميم التجريبي يسمح تحليل دقيق وقابلة للتكرار تصل إلى 15 الببتيدات ضد واحد أليل MHC II في 384 جيدا لوحة ELISA. باستخدام السائل واحد التعامل مع الروبوت، وهذا الأسلوب يسمح أحد الباحثين لتحليل ما يقرب من تسعين الببتيدات اختبار في ثلاث نسخ على مجموعة من ثمانية تجمعات وأربعة أنواع أليل MHC الثاني في أقل من 48 ساعة. غيرهم من العاملين في مجالات البروتين deimmunization أو تصميم وتطوير لقاح قد تجد البروتوكول أن تكون مفيدة في تسهيل عملهم. على وجه الخصوص، وتعليمات خطوة بخطوة والشكل البصريمن إن الرب يجب السماح للمستخدمين الآخرين بسرعة وسهولة لإنشاء هذه المنهجية في مختبرات خاصة بهم.

تم تحليل تسلسل الببتيد ناضجة من الأمعائية المذرقية P99 بيتا اكتاماز (جيش تحرير بلوشستان) (بنك الجينات رقم # X07274.1) مع ProPred 16 لدنة الببتيد المفترضة لMHC II أليل DRB1 * 1501 (جدول 4). حددت ProPred 117 الببتيدات nonamer مع إلزامية P1 مرساة بقايا (أي M، L، I، V، F، Y، W أو في ا...

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes at JoVE.com

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

يمكن فحوصات البيوكيميائية مع المؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم سريع، رؤى الكمي في تحديد حاتمة المناعية، الحذف، أو التصميم. هنا، يوصف مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II تحجيم لوحات 384 جيدا. هذا الشكل فعالة من حيث التكلفة يجب أن تكون مفيدة في مجالات deimmunization البروتين وتصميم لقاح والتنمية.

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

المستضد CD4 + تصور معين باستخدام خلايا T MHC الدرجة الثانية Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

تحليل كمي لياقة سير العمل

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...