Name: a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00
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Ce travail a été financé par des subventions du NIH R01-GM-098 977 et R21-AI-098 122 à CBK et KEG. RSS a été financé en partie par une fondation Luce Bourse et en partie par une bourse du Programme d&#39;innovation de l&#39;École Thayer Thayer de génie.

Quatre activités principales comprennent l&#39;analyse de liaison peptide-CMH II: 1-Reliure: peptides essai en concurrence avec des peptides de contrôle marquées pour la liaison phase de solution de protéines CMH II solubles. La liaison est mesurée sur une large plage de concentrations de peptides d&#39;essai. 2-Capture: Après la réaction de liaison se rapproche de l&#39;équilibre, des complexes peptide-CMH II sont saisis et séparés l&#39;un de peptide non lié et de protéines de reconnaissance dépendant de ...

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Biotherapeutics se sont imposés comme une pierre angulaire de la médecine moderne, ce qui représente quatre des cinq premiers médicaments les plus vendus en 2012 32. Le secteur de la biopharmaceutique a connu une croissance soutenue depuis plusieurs années 6, et le développement continu de nouveaux agents ainsi que l&#39;émergence des biosimilaires a élargi pipelines biopharmaceutiques. Pour l&#39;avenir, l&#39;évaluation et l&#39;atténuation de l&#39;immunogénicité des protéines thér...

Les protéines sont les plus rapides de croissance classe d&#39;agents thérapeutiques 6, et l&#39;expansion rapide des pipelines biothérapeutiques a attiré l&#39;attention de plus en plus sur les défis liés au développement et à l&#39;utilisation de médicaments protéiques. Une considération unique, provient du fait que, dans un système immunitaire sain et fonctionnel, toutes les protéines extracellulaires sont échantillonnés par des cellules présentatrices d&#39;antigène (CPA). Une fois internalisé par les CPA, une protéine est clivé en petits fragments peptidiques, et des segments immunogènes putatifs sont chargées dans la rainure de classe II protéines du complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH-II). Les complexes peptide-CMH II sont alors affichés sur la surface d&#39;APC, et des peptides immunogènes vrais, appelés épitopes de cellules T, former des complexes de récepteurs cellulaires ternaires CMH II-peptide-T avec T CD4 apparentées récepteurs de surface cellulaire 7. Cet événement de reconnaissance moléculaire critique initie une cascade de signalisation complexe, ce qui entraîne l&#39;activation des lymphocytes T, la libération de cytokines, T CD4 maturation des cellules B à médiation cellulaire et, finalement, la production d&#39;anticorps circulants IgG qui se lient à et défrichent la protéine exogène de la délinquance. Ainsi, les protéines immunogènes peuvent être deimmunized par identification d&#39;épitopes de cellules T constitutifs et la mutation de résidus clés responsables de la formation du complexe CMH II. Il convient de noter, toutefois, que des épitopes de lymphocytes T peuvent être nombreuses et largement distribué dans les protéines immunogènes, et la majorité des mutations d&#39;épitopes-suppression sont susceptibles de causer une perte involontaire d&#39;une fonction de la protéine ou la stabilité. Par conséquent, l&#39;ingénierie deimmunized biothérapies peut être un objectif complexe et techniquement difficile, mais il existe plusieurs exemples de succès épitope projets 3,5,8-12 de suppression t. Contrairement à la base de greffage &quot;humanisation&quot;, qui est largement limitée aux anticorps thérapeutiques, épitope deletion peut être appliqué à pratiquement n&#39;importe quelle protéine cible indépendamment de la séquence, la structure, la fonction ou la disponibilité de homólogonous échafaudages humains. La première étape de la mise en oeuvre d&#39;une telle approche est l&#39;identification d&#39;épitopes peptidiques clés incorporées à l&#39;intérieur de la séquence de protéine cible. Haut débit essais biochimiques utilisant des peptides synthétiques et des molécules du CMH II recombinantes humaines peuvent fournir des indications préliminaires rapides dans l&#39;identification de l&#39;épitope et l&#39;atténuation 1,3-5. Ces tests de type ELISA peut être un puissant complément à d&#39;autres conception et de développement d&#39;outils de protéines / vaccins. Par exemple, une approche expérimentale bien établie à la cartographie d&#39;épitopes repose sur le temps, le travail, et de ressources ex vivo des tests de prolifération cellulaire intensifs 15. En bref, la séquence primaire d&#39;une protéine-cible est tout d&#39;abord divisée en un panneau de peptides chevauchants, souvent de 15-mers avec 12 résidus adjacents se chevauchent entre les peptides. Le panneau de peptide est synthétisé chimiquement et l&#39;immunogénicité de chaque peptide est testé dans l&#39;un de plusieurs dosages immunologiques qui emploient différentes bloo périphériquecellules d mononucléaires (PBMC) isolés à partir de donneurs humains 13,14. Pour assurer une plus grande confiance dans les résultats, les peptides sont généralement testés à répétition avec des PBMC à partir de 50 ou plus de donneurs différents. Dans les cas où deimmunization est l&#39;objectif ultime, le travail est encore aggravé par la nécessité de produire des panneaux supplémentaires de peptides mutés et tester les nouveaux panneaux de peptides dans des essais PBMC avant d&#39;introduire des mutations deimmunizing dans la protéine de pleine longueur pour l&#39;analyse fonctionnelle ultérieure 10. Bien que ces tests cellulaires restent l&#39;étalon-or pour évaluer le potentiel immunogène chez des patients humains, l&#39;efficacité d&#39;une telle approche exhaustive pourrait être améliorée par préfiltrage épitopes immunogènes putatifs en utilisant un débit rapide et une grande analyse de liaison du CMH II-peptide. De même, des essais de liaison peptide-CMH II biochimiques peuvent être combinés avec de prédiction in silico pour accélérer radicalement le processus d&#39;identification de l&#39;épitope.Il existe une variété d&#39;outils de calcul pour la prédiction T épitope; exemples ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, BRA 19, SMM aligner 20, NetMHCIIpan 21 ainsi que des outils propriétaires tels que EpiMatrix par EpiVax 22. De même, les facteurs prédictifs d&#39;épitopes ont récemment été combinées avec d&#39;autres bio-informatique et des outils de modélisation moléculaire pour obtenir des algorithmes de deimmunization de protéines intégrées visant à atténuer le risque que les mutations deimmunizing risque de perturber la structure et la fonction des protéines 23-26. Bien que plusieurs prédicteurs d&#39;épitopes sont avérés être raisonnablement précis 27,28, des résultats de calcul nécessitent invariablement validation expérimentale. Rapide, à haut débit, et rentables méthodes expérimentales sont mieux adaptés comme un filtre préliminaire pour en silico prédictions d&#39;épitopes. Dans la même veine, les facteurs prédictifs d&#39;épitopes peuvent conduire sélection d&#39;antigène pour vaccinolo inversegie 29,30. Par exemple, les progrès de la bioinformatique ont donné des écrans du génome entier qui identifient rapidement des vaccins candidats sous la forme de protéines entières ou épitopes peptidiques extraits de protéomes pathogènes. Bien que cette technologie permet de redessiner la découverte et le développement de vaccins protecteurs, elle introduit un nouveau défi sous la forme d&#39;irréductiblement grandes listes de candidats vaccins immunogènes. Des dosages de liaison à haut débit peptide-CMH II peuvent guider le choix de l&#39;épitope en quantifiant l&#39;affinité de liaison peptidique et la promiscuité de liaison entre plusieurs allèles du CMH II. Comme avec la protéine deimmunization, ces méthodes expérimentales sont finalement nécessaires pour valider la prédiction de calcul de pistes de vaccins prometteurs. Ici, un test de liaison peptide-CMH II à l&#39;échelle au format 384 puits est décrit. Le protocole est très parallélisée et réduit les coûts de réactifs de 75% par rapport à précédemment décrit 96 puits formats de plaques 1,3-5. L&#39;utilisation d&#39;un seul liquidationd robot de manipulation, cette méthode permet un chercheur d&#39;analyser facilement environ quatre peptides d&#39;essai en triple exemplaire, dans une gamme de huit concentrations et quatre types d&#39;allèles du CMH II en moins de 48 heures. Cet article décrit l&#39;installation d&#39;une plaque de 384 puits ELISA pour l&#39;analyse de sept peptides expérimentaux contre un allèle du CMH II, mais les calculatrices de feuilles réparties sont fournies comme matériel supplémentaire afin d&#39;étendre facilement l&#39;expérience à un certain nombre de peptides et / ou MHC souhaités molécules II.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

Dosages biochimiques avec des molécules du CMH II recombinants humains peuvent fournir des indications rapides quantitatives dans l&#39;identification de l&#39;épitope immunogène, la suppression, ou la conception 1,2. Ici, un test de liaison peptide-CMH II est redimensionné au format de 384 puits. Le protocole mis à l&#39;échelle vers le bas permet de réduire les coûts de réactifs de 75% et est un débit plus élevé que précédemment décrit les protocoles de 96 puits 1,3-5. Plus précisément, la conception expérimentale permet l&#39;analyse robuste et reproductible d&#39;un maximum de 15 peptides contre un allèle du CMH II à 384 puits par plaque ELISA. L&#39;utilisation d&#39;un seul robot de manipulation de liquide, cette méthode permet d&#39;analyser un chercheur environ quatre-vingt dix peptides d&#39;essai, en triple sur une gamme de concentrations huit et quatre types d&#39;allèles du CMH II en moins de 48 h. Autres personnes travaillant dans les domaines de la deimmunization de protéines ou de la conception et le développement de vaccins peuvent trouver le protocole à être utile pour faciliter leur propre travail. En particulier, les instructions et le format visuel, étape par étapede Jupiter devrait permettre à d&#39;autres utilisateurs d&#39;établir rapidement et facilement cette méthodologie dans leurs propres laboratoires.

La séquence peptidique mature de Enterobacter cloacae P99 bêta-lactamase (BLA) (Genbank ID # X07274.1) a été analysée avec ProPred 16 pour les liants peptidiques MHC II putatifs à l&#39;allèle DRB1 * 1501 (tableau 4). ProPred identifié 117 peptides nonamères avec un résidu d&#39;ancrage P1 obligatoire (soit un M, L, I, V, F, Y ou W à la position 1, qui est nécessaire pour CMH II de liaison 31). À un seuil de 5%, que des peptides avec des scores supér...

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A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Dosages biochimiques avec des molécules du CMH II recombinants humains peuvent fournir des indications rapides quantitatives dans l&#39;identification de l&#39;épitope immunogène, la suppression, ou la conception. Ici, une analyse de liaison peptide-CMH II à l&#39;échelle de plaques à 384 puits est décrite. Ce format rentable devrait se révéler utile dans les domaines de deimmunization de protéine et la conception et le développement de vaccins.

Un essai de liaison à haut débit CMH II pour l&#39;analyse quantitative du peptide épitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

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Biology

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