Name: a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes at JoVE.com

이 작품은 NIH 보조금 R01-GM-098977 및 CBK와 KEG에 R21-AI-098122에 의해 지원되었다. RSS는 공학 이어 학교에서 이어 혁신 프로그램 원정대에 의해 루스 재단 원정대에 의해 부분적으로 부분적으로 지원되었다.

네 개의 주요 활동은 펩티드-MHC II 결합 분석을 포함한다 : 1 바인딩 : 시험 펩티드 용액 상 용해 MHC II 단백질의 결합을 표지 제어 펩티드와 경쟁. 바인딩은 테스트 펩티드 농도의 넓은 범위에 걸쳐 측정된다. 2 - 화면 캡쳐 : 바인딩 반응이 평형에 도달 한 후, 펩타이드 MHC II 단지가 캡처 및 고정 된 항체와 형태에 의존하는 인식하여 결합되지 않은 펩타이드와 단백질에서 분리된다. 3 탐지 : 캡처 제?...

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	<li>Steere, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-refractory+Lyme+arthritis+is+associated+with+HLA-DR+molecules+that+bind+a+Borrelia+burgdorferi+peptide.">Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide.</a> J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).</li><li>Raddrizzani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+peptide+interaction+enable+HLA-DQ+and+HLA-DR+molecules+to+bind+diverse+peptide+repertoires.">Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires.</a> J. Immunol. 159, 703-711 (1997).</li><li>Osipovitch, D. 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Biotherapeutics에 2012 년 32에서 상위 5 개 판매 약의 네를 대표하는 현대 의학의 초석로 자신을 설립했다. 바이오 의약 부문은 몇 년 6 지속 성장을 보여 왔으며, 새로운 에이전트의 지속적인 발전뿐만 아니라 바이오시 밀러의 등장은 바이오 의약품 파이프 라인을 확장했다. , 미래를 찾고 평가하고 단백질 치료제의 면역 원성을 완화하는 것은 초기 단계의 biotherapeutic 개발의 중요한 부...

단백질 치료제 6의 가장 빠르게 성장하고있는 클래스이며, biotherapeutic 파이프 라인의 급속한 확장은 단백질 의약품의 개발 및 사용과 관련된 문제에 대한 증가하는 관심을 집중하고있다. 하나의 고유 한 고려 사항은 건강 기능 면역 시스템의 모든 세포 단백질이 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 샘플링되고 있다는 사실에서 유래한다. 일단 장갑차에 의해 내면화, 단백질은 작은 펩타이드 조각으로 절단하고, 추정 면역 원성 세그먼트 클래스 II 주요 조직 적합성 복합체 단백질 (MHC II)의 홈에로드됩니다. 펩티드-MHC II 복합체 후 APC 표면 상에 표시하고, 진정한 면역 원성 펩티드는, 동족 CD4 T 세포 표면 수용체 7과의 삼원 MHC II-펩티드-T 세포 수용체 복합체를 형성하고, T 세포 에피토프를 지칭한다. 이 중요한 분자 인식 이벤트는 T 세포 활성화에 결과 복잡한 신호 폭포, 사이토 카인의 방출을 시작합니다의, CD4 T 세포 매개 성 B 세포의 성숙, 그리고 바인딩과 잘못된 외래 단백질을 취소의 IgG 항체를 순환 궁극적으로 생산. 따라서, 면역 원성 단백질을 구성하는 T 세포의 항원을 확인하고 MHC II 복합체 형성에 대한 책임이 키 잔류 돌연변이에 의해 deimmunized 될 수 있습니다. 이는 T 세포 에피토프가 많고 광범위 면역 원성 단백질에 걸쳐 분산 될 수 있다는 것은 주목 부담 및 에피토프 삭제 돌연변이의 대부분은 단백질 기능 또는 안정성의 부주의 손실이 발생할 가능성이있다. 따라서 엔지니어링 biotherapies가 복잡하고 기술적으로 도전적인 목표 일 수있다 deimmunized하지만, 성공적인 T 세포 에피토프 삭제 프로젝트 3,5,8-12의 몇 가지 예는 존재한다. 큰폭 항체 치료제에 한정되는 그라프 기반 &quot;인간화&quot;달리 에피토프 삭제 불문 서열, 구조, 기능을 본질적으로 임의의 단백질 표적에 적용될 수 있고, 또는 homologo의 가용성우리 인간의 골격. 이러한 접근 방식을 구현하는 첫 번째 단계는 표적 단백질 서열 내에 삽입 키 펩티드 에피토프의 확인이다. 합성 펩티드 및 재조합 인간 MHC II 분자를 사용하여 높은 처리량 생화학 적 분석은 에피토프 식별 및 완화 1,3-5에 빠른 예비 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 ELISA 유형 분석은 다른 단백질 / 백신 설계와 개발 도구의 강력한 보완 할 수 있습니다. 예를 들어, 에피토프 매핑 한 잘 설립 된 실험 방법은 시간, 노동에 의존하고 집중적 인 생체 세포 증식 시험 법 (15) 자원. 요약하면, 표적 단백질의 기본 시퀀스가​​ 제 겹치는 펩타이드의 패널로 분할되고, 12 잔기 종종 15 머는 인접한 펩티드에 대한 중복. 펩티드 패널은 화학적으로 합성되는 각 펩티드의 면역 원성은 주연 bloo 사용해 여러 면역 분석법 중 하나에서 시험된다인간 공여자로부터 단리 13,14 D 단핵 세포 (PBMC). 결과에 더 큰 신뢰를 제공하기 위해, 펩티드는 일반적으로 50 개 이상의 다른 기증자로부터 PBMC와 복제에 시험한다. deimmunization 궁극적 인 목표입니다 경우, 작업은 변이 된 펩티드의 추가 패널을 생산하고 이후의 기능 분석 (10)의 전체 길이의 단백질로 어떤 deimmunizing 돌연변이를 도입하기 전에 PBMC의 분석에 새로운 펩타이드 패널을 테스트하기 위해 필요에 의해 더욱 악화된다. 이러한 세포의 분석은 인간의 환자에서 면역 원성 가능성을 평가하기위한 황금 표준 남아 있지만, 이러한 철저한 접근 방식의 효율성은 신속하고 높은 처리량 MHC II-펩타이드 결합 분석을 이용하여 추정 면역 원성 항원을 사전 필터링에 의해 개선 될 수 있습니다. 마찬가지로, 생화학 펩티드-MHC II 결합 분석은 라디칼 에피토프 식별 프로세스를 가속화하기 위해 실리 방법의 예측과 조합 될 수있다.T 세포 에피토프 예측을위한 전산 다양한 도구가 존재, 예 ProPred (16)를 포함, MHCPred 17 SVRMHC 18, ARB 19, 20 SMM-정렬, NetMHCIIpan 21뿐만 아니라 EpiVax (22)에 의해 같은 EpiMatrix 같은 독점 도구를 제공합니다. 마찬가지로, 에피토프의 예측은 최근에 다른 생물 정보학 및 deimmunizing 돌연변이가 단백질의 구조와 기능 23-26를 중단시킬 위험을 완화하도록 설계된 통합 단백질 deimmunization 알고리즘을 생성하는 분자 모델링 도구와 결합되었습니다. 여러 가지 에피토프 예측이 합리적으로 정확한 27,28 것으로 입증되었지만, 계산 결과는 변함없이 실험적인 검증을 필요로한다. 빠른, 높은 처리량 및 비용 효과적인 실험 방법은 실리 에피토프 예측에 대한 예비 필터로 가장 적합합니다. 비슷한 맥락에서, 에피토프 예측 역 vaccinolo에 대한 항원의 선택을 구동 할 수있다GY (29, 30). 예를 들어, 생물 정보학의 발전은 빠르게 병원체 프로테옴에서 추출한 전체 단백질이나 펩티드 에피토프의 형태로 백신 후보를 식별하는 전체 게놈 화면을 수득했다. 이 가능하게 기술 보호 백신의 발견과 개발을 재편하는 동안, 그것은 면역 백신 후보의 intractably 큰 목록의 형태로 새로운 도전을 소개합니다. 높은 처리량 펩티드-MHC II 결합 분석은 펩타이드 결합 친화도를 정량화하고 여러 MHC II 대립 유전자 사이에 성행위를 결합하여 항원의 선택을 안내 할 수 있습니다. 단백질 deimmunization와 마찬가지로, 이러한 실험 방법은 궁극적으로 유망한 백신 리드의 계산 예측을 검증해야합니다. 여기에, 384도 형식으로 축소 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 프로토콜은 고도로 병렬화 이전에 96 - 웰 플레이트 형식 1,3-5 설명에 비해 최대 75 %에 의해 시약 비용을 절감 할 수 있습니다. 단일 LIQUI 사용D 로봇을 처리,이 방법은 하나의 연구자가 쉽게 미만 48 시간에서 여덟 농도와 네 MHC II 대립 유전자 유형의 범위 세중 약 구십 테스트 펩티드를 분석 할 수 있습니다. 이 문서는 하나의 MHC II 대립 유전자에 대한 일곱 실험 펩타이드의 분석을위한 하나의 384 - 웰 ELISA 플레이트의 설치를 설명하지만 쉽게 원하는 펩타이드 및 / 또는 MHC의 숫자로 실험을 확장 할 수 있도록 확산 시트 계산기는 보충 자료로 제공됩니다 II 분자.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 또는 디자인 1,2를 제공 할 수 있습니다. 여기, 펩타이드 MHC II 결합 분석은 384도 형식으로 조정됩니다. 축소 프로토콜 75 %의 시약 비용을 절감하고 이전에 96 - 웰 프로토콜 1,3-5 기술보다 더 높은 처리량입니다. 특히, 실험 설계는 384도 ELISA 플레이트 당 하나의 MHC II 대립 유전자에 대해 최대 15 펩티드의 강력하고 재현성있는 분석을 허용합니다. 하나의 액체 처리 로봇을 사용하여,이 방법은 하나의 연구자 미만 48 시간에서 여덟 농도와 네 MHC II 대립 유전자 유형의 범위 세중 약 구십 테스트 펩티드를 분석 할 수 있습니다. 단백질 deimmunization 또는 백신의 설계 및 개발 분야에서 일하는 다른 프로토콜이 자신의 작업을 촉진하는데 유용하게 찾을 수 있습니다. 특히, 단계별 지침과 시각적 형식주피터의 다른 사용자가 빠르고 쉽게 자신의 실험실에서이 방법을 확립 할 수 있도록해야한다.

엔테로 박터 클로 아카 P99 베타 - 락타 마제 (BLA) (Genbank에 ID 번호의 X07274.1)의 성숙 펩타이드 서열은 MHC II 대립 유전자 DRB1 * 1501 (표 4)으로 추정 펩타이드 바인더 ProPred (16)를 분석 하였다. ProPred은 필수 P1 앵커 잔류 물 117 nonamer 펩티드를 확인 (즉, M, L, I, V, F, Y, 31 바인딩 MHC II에 필요한 위치 1에서 W). 5 %의 임계 값으로 만보다 큰 득점 2.6 같은지 가능성 바인...

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A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

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We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

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리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

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used in establishing ...

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Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

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후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

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