Name: a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01-GM-098977 e R21-AI-098122 a CBK e KEG. RSS foi apoiado em parte por uma Luce Foundation Fellowship e, em parte, por um Fellowship Thayer Programa de Inovação da Escola de Engenharia Thayer.

Quatro principais atividades compreendem o ensaio de ligação peptídeo-MHC II: 1-Encadernação: peptídeos de teste competir com peptídeos de controle marcados para a ligação fase de solução de proteínas MHC II solúveis. A ligação é medida ao longo de uma vasta gama de concentrações de péptidos de teste. 2-Captura: Após a reacção de ligação se aproxima do equilíbrio, complexos de péptido-MHC II são capturadas e separadas a partir do péptido não ligado e proteína de reconhecimento dependente da...

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Biotherapeutics se estabeleceram como um dos pilares da medicina moderna, o que representa quatro dos cinco melhores vendendo drogas em 2012 32. O setor biopharmaceutics tem mostrado um crescimento sustentado por vários anos 6, eo desenvolvimento contínuo de novos agentes, bem como o surgimento de biossimilares ampliou pipelines biofarmacêutica. Olhando para o futuro, avaliar e mitigar a imunogenicidade de proteínas terapêuticas vai se tornar parte integrante da fase inicial de desenvolvimento...

As proteínas são a classe que mais cresce de agentes terapêuticos 6, e da rápida expansão de dutos bioterapêuticos tem se concentrado cada vez mais atenção sobre os desafios associados com o desenvolvimento e uso de drogas de proteína. Uma consideração única deriva do facto de que, em um sistema imunitário saudável e funcionamento, todas as proteínas extracelulares são recolhidos por células apresentadoras de antígenos (APCs). Uma vez internalizado por APCs, uma proteína é clivada em fragmentos de péptidos pequenos, e segmentos imunogénicas putativos são carregados para dentro da ranhura de classe II principais proteínas do complexo de histocompatibilidade (MHC II). Os complexos de péptido-MHC II são, então, exibidos na superfície da APC, e os verdadeiros péptidos imunogénicos, denominados epitopos de células T, receptores de células formar complexos ternários II do MHC-peptídeo T-CD4 com receptores da superfície celular cognato 7. Este evento crítico reconhecimento molecular inicia uma cascata de sinalização complexo, que resulta na activação de células T, a libertação de citocinas, a maturação de células B mediada por células T CD4 e, finalmente, a produção de anticorpos IgG circulantes que se ligam e limpar a proteína exógena ofensivo. Assim, as proteínas imunogénicas pode ser deimmunized por identificar epitopos de células T constituintes e mutando resíduos chave responsáveis ​​pela formação de complexos MHC II. Vale a pena notar, no entanto, que os epitopos de células T podem ser numerosas e amplamente distribuídos em todo proteínas imunogénicas, e a maioria das mutações-exclusão de epitopo são susceptíveis de provocar uma perda inadvertida da função da proteína ou estabilidade. Portanto, engenharia deimmunized bioterapias pode ser um objetivo complexo e tecnicamente difícil, mas existem vários exemplos de sucesso T epitopos de células projetos de eliminação 3,5,8-12. Ao contrário à base de enxerto de &quot;humanização&quot;, o qual é restrita a terapêutica do anticorpo, epitopo deleção pode ser aplicado a essencialmente qualquer proteína alvo, independentemente da sequência, estrutura, função ou disponibilidade de homólogonos andaimes humanos. O primeiro passo para implementar tal abordagem é a identificação de epítopos peptídicos principais incorporados dentro da sequência da proteína alvo. Alto rendimento ensaios bioquímicos, utilizando peptídeos sintéticos e moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidas idéias preliminares para identificação e mitigação epítopo 1,3-5. Estes ensaios do tipo ELISA pode ser um poderoso complemento de outros design e desenvolvimento de ferramentas de proteína / vacinas. Por exemplo, uma bem estabelecida abordagem experimental para mapeamento de epítopos depende de tempo, trabalho e recursos intensivos ex vivo ensaios de proliferação celular 15. Resumidamente, a sequência primária de uma proteína-alvo é primeiramente dividido em um painel de péptidos que se sobrepõem, muitas vezes de 15-meros com 12 resíduos de sobreposição entre os péptidos adjacentes. O painel de péptidos quimicamente sintetizados e a imunogenicidade de cada peptídeo é testado em um de vários imunoensaios diferentes que empregam bloo periféricaAs células mononucleares de d (PBMC) isoladas a partir de dadores humanos 13,14. Para proporcionar uma maior confiança nos resultados, os peptídeos são normalmente testadas em replicar com PBMC de 50 ou mais doadores diferentes. Nos casos em que deimmunization é o objetivo final, o trabalho é agravado ainda mais pela necessidade de produzir painéis adicionais de peptídeos mutantes e testar os novos painéis de peptídeos em ensaios de PBMC antes de introduzir quaisquer mutações deimmunizing na proteína de comprimento total para a análise funcional posterior 10. Embora estes ensaios celulares continuam a ser o padrão-ouro para avaliar o potencial imunogênico em pacientes humanos, a eficiência de uma abordagem exaustiva pode ser melhorada através de pré-filtragem epítopos imunogênicos putativos usando uma rápida e alta taxa de transferência ensaio de ligação MHC II-peptídeo. Da mesma forma, os ensaios de ligação bioquímicas péptido-MHC II pode ser combinado com métodos de previsão em silico para acelerar o processo de identificação radicalmente epitopo.Existem uma variedade de ferramentas computacionais para a predição epitopo de célula T; exemplos incluem ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM-alinhar 20, NetMHCIIpan 21, bem como ferramentas proprietárias, como EpiMatrix por EpiVax 22. Da mesma forma, os preditores de epítopos foram recentemente combinada com outras ferramentas de bioinformática e modelagem molecular para produzir algoritmos deimmunization proteína integrados projetados para reduzir o risco de que as mutações deimmunizing pode afectar a estrutura e função da proteína 23-26. Enquanto vários preditores epitopos têm provado ser razoavelmente precisa 27,28, resultados computacionais invariavelmente necessitam de validação experimental. Rápido, alto rendimento, e de baixo custo métodos experimentais são mais adequados como um filtro preliminar no previsões epítopos silico. Na mesma linha, os preditores de epítopos pode dirigir seleção antígeno para vaccinolo reversagy 29,30. Por exemplo, os avanços em bioinformática produziram telas genoma inteiro que identifica rapidamente os candidatos de vacina sob a forma de proteínas inteiras ou epitopos peptídicos extraídos do proteoma dos agentes patogénicos. Embora esta tecnologia capacitadora está reformulando a descoberta e desenvolvimento de vacinas protetoras, introduz um novo desafio na forma de intratável grandes listas de candidatos a vacinas imunogênicas. Ensaios de ligação alta capacidade peptídeo-MHC II podem orientar a seleção epítopo quantificando afinidade de ligação de peptídeos e promiscuidade de ligação entre alelos múltiplos MHC II. Tal como acontece com deimmunization proteína, tais métodos experimentais são em última instância é necessária para validar previsão computacional de ligações vacina promissora. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II em escala para o formato de 384 poços é descrito. O protocolo é altamente paralelizado e reduz o custo dos reagentes por 75% em relação ao anteriormente descrito 96 cavidades formatos de placa 1,3-5. Usando um único liquid manuseamento robô, este método permite que um investigador para analisar facilmente aproximadamente noventa péptidos de teste, em triplicado, durante um intervalo de oito concentrações e quatro tipos de alelos do MHC II, em menos de 48 horas. Este artigo descreve a configuração de uma placa de 384 poços de ELISA para análise de sete péptidos experimentais contra um alelo de MHC II, mas calculadoras folha distribuídos são fornecidos como material suplementar, de modo a dimensionar facilmente o experimento de qualquer número de péptidos e / ou MHC desejadas moléculas II.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

Ensaios bioquímicos com moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidos, insights quantitativos em identificação epítopo imunogênico, exclusão ou desenho 1,2. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II é dimensionado para o formato de 384 poços. O protocolo reduzida reduz o custo dos reagentes de 75% e é mais elevado do que o rendimento descrito anteriormente protocolos de 96 poços 1,3-5. Especificamente, o delineamento experimental permite uma análise robusta e reprodutível de até 15 péptidos contra um alelo de MHC II por 384 poços de placas de ELISA. Utilizando uma única manipulação robô líquido, este método permite que um investigador para analisar aproximadamente noventa péptidos de teste, em triplicado, durante um intervalo de oito concentrações e quatro tipos de alelos do MHC II, em menos de 48 horas. Outros que trabalham nas áreas de deimmunization proteína ou projeto e desenvolvimento de vacinas pode achar o protocolo a ser útil para facilitar o seu próprio trabalho. Em particular, as instruções passo-a-passo eo formato visualde Jove deve permitir que outros usuários para estabelecer de forma rápida e facilmente esta metodologia em seus próprios laboratórios.

A sequência do péptido maduro de Enterobacter cloacae P99 beta-lactamase (BLA) (GenBank ID # X07274.1) foi analisada com ProPred 16 por ligantes peptídicos putativos para MHC II alelo DRB1 * 1501 (Tabela 4). ProPred identificado 117 peptídeos nonâmero com um resíduo P1 âncora obrigatória (isto é, uma M, L, I, V, F, Y ou W na posição 1, que é necessária para MHC II 31 de ligação). Em um limiar de 5%, apenas peptídeos com pontuação maior ou igual a...

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A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Ensaios bioquímicos com moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidos, insights quantitativos em identificação epítopo imunogênico, exclusão ou design. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II dimensionado para placas de 384 poços é descrito. Este formato de baixo custo deve ser útil nos campos da deimmunization proteína e design e desenvolvimento de vacinas.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

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