Name: a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH гранты R01-GM-098977 и R21-AI-098122 для ЦБК и бочкой. RSS частично поддержана на стипендии Фонда Luce и частично за счет программы Тайер Инновации стипендий от Thayer техническая школа.

Четыре основные мероприятия включают в себя анализ связывания пептида-MHC II: 1-Переплет: тест-пептидов конкурировать с меченых пептидов контроля за фазу раствора связывания растворимых белков MHC II. Связывание измеряется в широком диапазоне концентраций пептида испытаний. 2-захвата: Посл...

<ol>
	<li>Steere, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-refractory+Lyme+arthritis+is+associated+with+HLA-DR+molecules+that+bind+a+Borrelia+burgdorferi+peptide.">Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide.</a> J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).</li><li>Raddrizzani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+peptide+interaction+enable+HLA-DQ+and+HLA-DR+molecules+to+bind+diverse+peptide+repertoires.">Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires.</a> J. Immunol. 159, 703-711 (1997).</li><li>Osipovitch, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+immune-evading+enzymes+for+ADEPT+therapy.">Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy.</a> Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).</li><li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico-accelerated+identification+of+conserved+and+immunogenic+variola/vaccinia+T-cell+epitopes.">In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes.</a> Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).</li><li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+HLA+DR+epitope+de-immunization+of+Factor+VIII+in+vitro+and+in+vivo.">Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo.</a> Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).</li><li>Aggarwal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+fueling+the+biotech+engine-2011+to+2012.">What's fueling the biotech engine-2011 to 2012.</a> Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Warmerdam, P. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+a+human+T-cell+region+in+staphylokinase+by+T-cell+screening+and+computer+modeling.">Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling.</a> Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).</li><li>Jones, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+removal+of+a+promiscuous+CD4+T+cell+epitope+from+the+C1+domain+of+factor+VIII.">Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII.</a> J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).</li><li>Harding, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beta-lactamase+with+reduced+immunogenicity+for+the+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+using+antibody-directed+enzyme+prodrug+therapy.">A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy.</a> Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).</li><li>Mazor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+elimination+of+an+immunodominant+T-cell+epitope+in+recombinant+immunotoxins+based+on+Pseudomonas+exotoxin+A.">Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).</li><li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+enzyme+deimmunization+by+combinatorial+T-cell+epitope+removal+using+neutral+drift.">Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).</li><li>Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Ag-specific+immune+responses:+understanding+immunopathogenesis+and+improving+diagnostics+in+infectious+disease,+autoimmunity+and+cancer.">Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer.</a> Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).</li><li>Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+T+epitope+mapping+and+vaccine+development.">High throughput T epitope mapping and vaccine development.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).</li><li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry.">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li><li>Singh, H., Raghava, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProPred:+prediction+of+HLA-DR+binding+sites.">ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.</a> Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).</li><li>Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCPred:+bringing+a+quantitative+dimension+to+the+online+prediction+of+MHC+binding.">MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding.</a> Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).</li><li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SVRMHC+prediction+server+for+MHC-binding+peptides.">SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides.</a> BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).</li><li>Bui, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+generation+and+evaluation+of+specific+MHC+binding+predictive+tools:+ARB+matrix+applications.">Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications.</a> Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).</li><li>Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+MHC+class+II+binding+affinity+using+SMM-align,+a+novel+stabilization+matrix+alignment+method.">Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method.</a> BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).</li><li>Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCIIpan-2.0+-+Improved+pan-specific+HLA-DR+predictions+using+a+novel+concurrent+alignment+and+weight+optimization+training+procedure.">NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure.</a> Immun. Res. 6, 9 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De-immunization+of+therapeutic+proteins+by+T-cell+epitope+modification.">De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification.</a> Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).</li><li>Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+redesign+of+proteins+for+minimal+T-cell+epitope+content.">Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content.</a> J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).</li><li>Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins.</a> J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).</li><li>Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+therapeutic+proteins+to+delete+T-cell+epitopes+while+maintaining+beneficial+residue+interactions.">Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions.</a> J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).</li><li>Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+algorithms+for+functional+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins.</a> BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+risk,+improving+outcomes:+Bioengineering+less+immunogenic+protein+therapeutics.">Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics.</a> Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+assessment+of+MHC+class+II+peptide+binding+predictions+and+evaluation+of+a+consensus+approach.">A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).</li><li>Sette, A., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+vaccinology:+developing+vaccines+in+the+era+of+genomics.">Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics.</a> Immunity. 33, 530-541 (2010).</li><li>Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines.">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li><li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices.">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales.">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636 (2012).</li><li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics:+a+decade+of+reverse+vaccinology.">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li><li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC.">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li><li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays.">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li></ol>

Биотерапевтических зарекомендовали себя в качестве краеугольного камня современной медицины, представляющие четыре из пяти лучших продающих наркотики в 2012 году 32. Сектор биофармацевтика показал устойчивый рост в течение нескольких лет 6, и постоянное развитие новых преп?...

Белки являются самым быстрорастущим класс терапевтических агентов 6, и быстрое расширение биотерапевтических трубопроводов была сосредоточена больше внимания на проблемы, связанные с развитием и использованием белковых препаратов. Одной из уникальных рассмотрение проистекает из того факта, что в здоровой и функционирующей иммунной системе, все внеклеточные белки дискретизированных с помощью антиген-представляющих клеток (АРС). После интернализации АПК, белок расщепляется на небольших пептидных фрагментов, и предполагаемые иммуногенные сегменты будут загружены в паз класса II главного комплекса гистосовместимости (MHC белков II). Комплексы пептид-МНС II затем отображаются на поверхности АПК, и истинные иммуногенные пептиды, называемые Т-клеточные эпитопы, образуют тройные комплексы МНС II-пептид-Т-клеточного рецептора с родственными рецепторами клеточной поверхности CD4-Т-7. Это критическое событие молекулярное распознавание инициирует сигнальный каскад сложный, что приводит к активации Т-клеток, высвобождение цитокинасек, CD4 Т клеточный созревание В-клеток, и в конечном счете производство циркулирующих IgG антитела, которые связываются с и очистить нарушителя экзогенный белок. Таким образом, иммуногенные белки могут быть deimmunized путем выявления учредительные клеточные эпитопы Т и мутирует ключевые остатки, ответственные за образование комплекса MHC II. Он несет отметить, однако, что Т-клеточные эпитопы могут быть многочисленными и широко распространены по всему иммуногенных белков, и большинство эпитоп-удаление мутаций могут вызвать непреднамеренный потерю функции белка или стабильности. Поэтому, машиностроение deimmunized Biotherapies может быть сложным и технически сложной задачей, но существуют несколько примеров успешных Т-клеточный эпитоп на удаление проектов 3,5,8-12. В отличие от прививки на основе &quot;гуманизации&quot;, которая в значительной степени ограничивается терапевтики антитела, Эпитоп удаление может быть применен к существу любая целевой белок независимо от последовательности, структура, функции, или наличие homologoнам человека леса. Первый шаг к реализации такого подхода является определение ключевых пептидных эпитопов, встроенных в последовательности белка-мишени. Высокая пропускная способность биохимические анализы с использованием синтетических пептидов и рекомбинантных молекул MHC II человека может обеспечить быстрые предварительные глубокого анализа выявления эпитопной и смягчения 1,3-5. Эти анализы типа ИФА может быть мощным дополнением к другим проектирования и разработки инструментов белка / вакцин. Например, один хорошо известна экспериментальный подход к картирования эпитопов зависит от времени, труда и ресурсоемких Экс Vivo клеточной пролиферации анализов 15. Вкратце, первичной последовательности белка-мишени сначала разделена на панели перекрывающихся пептидов, часто 15-меров с 12 остатков перекрываются между соседними пептидов. Пептид панель химически синтезированы и иммуногенность каждого пептида был протестирован в одном из нескольких различных иммунологических, которые используют периферийное Blooг одноядерные клетки (РВМС), выделенные из человеческих доноров 13,14. Чтобы обеспечить большую уверенность в результатах, пептиды, как правило, проходят в репликации с РВМС от 50 и более различных доноров. В случаях, когда deimmunization является конечной целью, работа осложняется дополнительно в связи с необходимостью получения дополнительных панелей мутированных пептидов и испытать новые пептидные панелей в РВМС анализов, прежде чем внедрять любые deimmunizing мутаций в полноразмерного белка для последующего функционального анализа 10. Хотя эти клеточные анализы остаются золотым стандартом для оценки иммунного потенциала в человеческих пациентов, эффективность такого исчерпывающего подхода может быть улучшена путем предварительная фильтрация предполагаемые иммуногенные эпитопы с помощью быстрого и высокую пропускную способность MHC II-пептид св зывание. Кроме того, биохимические анализы связывания пептид-МНС II могут быть объединены с предсказательной в методах кремний радикально ускорить процесс идентификации эпитопа.Там существует множество вычислительных средств для T прогнозирования клеток эпитопной; примеры включают ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, АРБ 19, СММ-выровнять 20, NetMHCIIpan 21, а также собственные инструменты, такие как EpiMatrix по EpiVax 22. Кроме того, эпитопные предсказатели были недавно объединены с другими биоинформатики и молекулярных инструментов моделирования, и получают комплексные белковые алгоритмы deimmunization, направленные на снижение риска, что deimmunizing мутации могут нарушать работу структуру и функции белков 23-26. В то время как несколько эпитопные предсказатели оказались достаточно точными 27,28, результаты расчетов неизменно требуют экспериментальной проверки. Быстрая, высокая пропускная способность и экономически эффективным экспериментальные методы лучше всего подходят в качестве предварительного фильтра для в кремний предсказаний эпитопных. В том же духе, эпитопные предсказатели может управлять выбор антигена для обратного vaccinoloгы 29,30. Например, прогресс в области биоинформатики дали весь геном экраны, которые быстро идентифицировать вакцин-кандидатов в виде целых белков или пептидных эпитопов патогенов, извлеченных из протеомов. Хотя это позволяет технология является перестройка открытие и развитие защитных вакцин, он вводит новый вызов в виде непреклонно больших списков кандидатов иммуногенных вакцин. Анализы связывания Высокая пропускная пептид-MHC II может вести выбор эпитопную путем количественного пептидный аффинность связывания и связывания распущенность среди множественных аллелей MHC II. Как и белка deimmunization, такие экспериментальные методы, в конечном счете требуется для проверки вычислительную прогноз перспективных приводит вакцин. Здесь, анализ связывания пептида-MHC II масштабируется в формате 384-а описывается. Протокол является весьма параллельному и снижает затраты реагентов на 75% по сравнению с ранее описано 96-а форматы пластин 1,3-5. Использование одного Liquiд обработки робота, этот метод позволяет один исследователь легко анализировать приблизительно девяносто тестируемых пептидов в трех экземплярах в диапазоне концентраций и восемь четырех типов аллелей МНС II менее чем за 48 часов. В данной статье описывается настройка одной 384-а ELISA пластины для анализа семи экспериментальных пептидов против одной МНС II аллеля, но электронная таблица калькуляторы предоставляются как дополнительного материала таким образом, чтобы легко масштабировать эксперимент на любое количество нужных пептидов и / или MHC Молекулы II.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

Биохимические анализы с рекомбинантных молекул MHC II человека может обеспечить быстрые, количественные понимание иммуногенному идентификации эпитопной, удаление или дизайн 1,2. Здесь, анализ связывания пептида-MHC II масштабируется в формате 384-а. Уменьшено протокол снижает затраты реагентов на 75% и более высокую пропускную способность, чем описано выше протоколы 96-а 1,3-5. В частности, экспериментальная конструкция позволяет надежную и воспроизводимую анализ до 15 пептидов против одной МНС II аллеля на 384-а ELISA пластины. Использование одного обработки робота жидкости, этот метод позволяет исследователю анализировать примерно девяносто тестовые пептиды в трех экземплярах в диапазоне восьми концентраций и четырех типов аллелей MHC II менее чем за 48 часов. Другие работающие в области deimmunization белка или проектирования и разработки вакцины могут найти протокол, чтобы быть полезным в содействии их собственную работу. В частности, шаг за шагом инструкции и визуальном форматеЮпитера должны разрешить другим пользователям быстро и легко установить эту методологию в своих собственных лабораториях.

Зрелый пептид последовательность из Enterobacter клоаки P99 бета-лактамазы (BLA) (GenBank ID # X07274.1) анализировали с ProPred 16 для предполагаемых пептидных связующих до МНС II аллеля DRB1 * 1501 (табл. 4). ProPred определены 117 нонамера пептиды с обязательным Р1 якоря остатка (т.е. M, L, I, V, F, Y ил?...

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes at JoVE.com

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Биохимические анализы с рекомбинантных молекул MHC II человека может обеспечить быстрые, количественные понимание иммуногенному идентификации эпитопной, удаление или дизайн. Здесь, анализ связывания пептида-MHC II масштабируется до 384-луночных планшетах описывается. Это экономически эффективное формат должен оказаться полезным в области белка deimmunization и дизайна и разработки вакцины.

Анализ связывания Высокая пропускная МНС II для количественного анализа пептидных эпитопов

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Визуализация антиген Конкретные CD4 + Т-клеток с использованием МНС класс II тетрамеров

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Нейронов и астроцитов сотрудничеству культуры Пробирной высоких Анализ содержания Нейротоксичность

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Высокая пропускная способность осахаривания Пробирной для лигноцеллюлозной материалы

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Количественный анализ рабочих процессов Фитнес

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Высокая пропускная Функциональная Скрининг с использованием Домашнее двойного свечения люциферазы

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Проточной цитометрии бимолекулярного флуоресценции Комплементация: Высокая пропускная способность Количественный метод изучения взаимодействия белок-белок

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Высокая пропускная Микроинъекции из морского ежа зиготы

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...