Name: a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01-GM-098.977 och R21-AI-098.122 till CBK och KEG. RSS stöddes delvis av en Luce Foundation Fellowship och delvis av en Thayer Innovation Program Fellowship från Thayer School of Engineering.

Fyra stora verksamheter omfattar peptid-MHC-II-bindningsanalys: 1-Bindning: Test peptiderna konkurrera med märkta kontrollpeptider för lösningsfas bindning av lösliga MHC II-proteiner. Bindning mäts över ett brett område av testpeptidkoncentrationer. 2-Capture: Efter bindningsreaktionen närmar sig jämvikt, är peptid-MHC II-komplexen fångas och separeras från obunden peptid och protein genom konformationsberoende erkännande med en immobiliserad antikropp. 3-Detection: Fångad kontroll peptid kvantitativt det...

<ol>
	<li>Steere, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-refractory+Lyme+arthritis+is+associated+with+HLA-DR+molecules+that+bind+a+Borrelia+burgdorferi+peptide.">Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide.</a> J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).</li><li>Raddrizzani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+peptide+interaction+enable+HLA-DQ+and+HLA-DR+molecules+to+bind+diverse+peptide+repertoires.">Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires.</a> J. Immunol. 159, 703-711 (1997).</li><li>Osipovitch, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+immune-evading+enzymes+for+ADEPT+therapy.">Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy.</a> Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).</li><li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico-accelerated+identification+of+conserved+and+immunogenic+variola/vaccinia+T-cell+epitopes.">In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes.</a> Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).</li><li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+HLA+DR+epitope+de-immunization+of+Factor+VIII+in+vitro+and+in+vivo.">Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo.</a> Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).</li><li>Aggarwal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+fueling+the+biotech+engine-2011+to+2012.">What's fueling the biotech engine-2011 to 2012.</a> Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Warmerdam, P. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+a+human+T-cell+region+in+staphylokinase+by+T-cell+screening+and+computer+modeling.">Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling.</a> Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).</li><li>Jones, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+removal+of+a+promiscuous+CD4+T+cell+epitope+from+the+C1+domain+of+factor+VIII.">Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII.</a> J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).</li><li>Harding, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beta-lactamase+with+reduced+immunogenicity+for+the+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+using+antibody-directed+enzyme+prodrug+therapy.">A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy.</a> Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).</li><li>Mazor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+elimination+of+an+immunodominant+T-cell+epitope+in+recombinant+immunotoxins+based+on+Pseudomonas+exotoxin+A.">Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).</li><li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+enzyme+deimmunization+by+combinatorial+T-cell+epitope+removal+using+neutral+drift.">Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).</li><li>Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Ag-specific+immune+responses:+understanding+immunopathogenesis+and+improving+diagnostics+in+infectious+disease,+autoimmunity+and+cancer.">Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer.</a> Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).</li><li>Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+T+epitope+mapping+and+vaccine+development.">High throughput T epitope mapping and vaccine development.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).</li><li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry.">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li><li>Singh, H., Raghava, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProPred:+prediction+of+HLA-DR+binding+sites.">ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.</a> Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).</li><li>Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCPred:+bringing+a+quantitative+dimension+to+the+online+prediction+of+MHC+binding.">MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding.</a> Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).</li><li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SVRMHC+prediction+server+for+MHC-binding+peptides.">SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides.</a> BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).</li><li>Bui, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+generation+and+evaluation+of+specific+MHC+binding+predictive+tools:+ARB+matrix+applications.">Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications.</a> Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).</li><li>Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+MHC+class+II+binding+affinity+using+SMM-align,+a+novel+stabilization+matrix+alignment+method.">Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method.</a> BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).</li><li>Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCIIpan-2.0+-+Improved+pan-specific+HLA-DR+predictions+using+a+novel+concurrent+alignment+and+weight+optimization+training+procedure.">NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure.</a> Immun. Res. 6, 9 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De-immunization+of+therapeutic+proteins+by+T-cell+epitope+modification.">De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification.</a> Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).</li><li>Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+redesign+of+proteins+for+minimal+T-cell+epitope+content.">Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content.</a> J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).</li><li>Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins.</a> J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).</li><li>Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+therapeutic+proteins+to+delete+T-cell+epitopes+while+maintaining+beneficial+residue+interactions.">Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions.</a> J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).</li><li>Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+algorithms+for+functional+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins.</a> BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+risk,+improving+outcomes:+Bioengineering+less+immunogenic+protein+therapeutics.">Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics.</a> Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+assessment+of+MHC+class+II+peptide+binding+predictions+and+evaluation+of+a+consensus+approach.">A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).</li><li>Sette, A., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+vaccinology:+developing+vaccines+in+the+era+of+genomics.">Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics.</a> Immunity. 33, 530-541 (2010).</li><li>Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines.">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li><li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices.">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales.">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636 (2012).</li><li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics:+a+decade+of+reverse+vaccinology.">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li><li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC.">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li><li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays.">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li></ol>

Biotherapeutics har etablerat sig som en hörnsten i modern medicin, som representerar fyra av de fem som säljer droger i 2012 32. Den biofarmaci sektorn har visat stadig tillväxt under flera år 6, och den pågående utvecklingen av nya medel samt uppkomsten av biosimilars har expand biofarmaceutiska rörledningar. Om man ser framåt, bedöma och mildra immunogenicitet av proteinläkemedel kommer att bli en integrerad del av tidigt biotherapeutic utveckling. För att underlätta denna process, k...

Proteiner är den snabbast växande klass av terapeutiska medel 6, och den snabba expansionen av biotherapeutic rörledningar har fokuserat allt större uppmärksamhet på de utmaningar som är förknippade med utveckling och användning av proteinläkemedel. En unik övervägande härrör från det faktum att i en sund och fungerande immunförsvar är alla extracellulära proteiner som samplas av antigenpresenterande celler (APC). När internaliseras av APC: er, är ett protein som klyvs i små peptidfragment, och förmodade immunogena segment är laddade in i spåret av klass II MHC-proteiner (MHC-II). De peptid-MHC-II komplexen visas sedan på APC-ytan och sanna immunogena peptider, benämnda T-cellsepitoper, bilda ternära MHC II-peptid-T-cellreceptorkomplex med cognate CD4 T-cellytereceptorer 7. Denna kritiska erkännande händelse molekyl initierar en komplex signalkaskad som resulterar i T-cellaktivering, frigivning av cytokins, CD4 T-cell-medierad B-cellsmognad och slutligen produktionen av cirkulerande IgG-antikroppar som binder till och rensa den felande exogena proteinet. Således kan immunogena proteiner deimmunized genom att identifiera ingående T-cellepitoper och mutera viktiga rester som är ansvariga för MHC II komplexbildning. Den bär att notera är dock att T-cellepitoper kan vara många och brett fördelade över immunogena proteiner, och majoriteten av epitop-radera mutationer kan orsaka en oavsiktlig förlust av proteiners funktion eller stabilitet. Därför ingenjörs deimmunized biotherapies kan vara en komplicerad och tekniskt utmanande mål, men det finns flera exempel på framgångsrika T-cellepitop radering projekt 3,5,8-12. Till skillnad från ympning baserade &quot;humanisering&quot;, som till stor del begränsat till antikroppsläkemedel, kan epitop radering appliceras på i stort sett alla proteiner mål oavsett sekvens, struktur, funktion, eller tillgången på homologooss mänskliga byggnadsställningar. Det första steget för att genomföra en sådan strategi är att identifiera viktiga peptidepitoper inbäddade inom målet proteinsekvensen. Hög genomströmning biokemiska analyser med hjälp av syntetiska peptider och rekombinanta humana MHC II molekyler kan ge snabba preliminära insikter epitop identifiering och begränsning 1,3-5. Dessa ELISA typ analyser kan vara ett kraftfullt komplement till andra protein / vaccin design-och utvecklingsverktyg. Till exempel, en väletablerad experimentell strategi för epitopkartläggning relies på tid, arbete och resursintensiva ex vivo cellproliferationsanalyser 15. Kortfattat är den primära sekvensen av ett målprotein först delas upp i en panel av överlappande peptider, ofta 15-merer med 12 rester överlappar mellan intilliggande peptider. Peptiden Panelen är kemiskt syntetiserade och immunogeniciteten av varje peptid testas i en av flera olika immunanalyser som använder perifert blood mononukleära celler (PBMC) som isolerats från humana givare 13,14. För att ge större förtroende för resultaten, peptider vanligtvis testas i replikera med PBMC från 50 eller fler olika givare. I de fall deimmunization är det slutliga målet, är det arbete förvärras ytterligare genom behovet av att producera ytterligare paneler av muterade peptider och testa de nya peptidpanelerna i PBMC analyser innan några deimmunizing mutationer i full längd protein för efterföljande funktionsanalys 10. Även om dessa cellulära analyser återstår guldmyntfoten för att bedöma immunogena potentialen hos människor, kan effektiviteten i ett sådant uttömmande tillvägagångssätt kunna förbättras genom förfiltrering förmodade immunogena epitoper med hjälp av en snabb och hög kapacitet MHC II-peptidbindningsanalys. På samma sätt kan biokemiska peptid-MHC II bindningsanalyser kombineras med prediktiv i silico metoder för att radikalt påskynda epitop identifieringsprocessen.Det finns en rad olika beräkningsverktyg för T-cell-epitop förutsägelse, exempel är ProPred 16, MHCPred 17 SVRMHC 18, ARB 19, SMM-align 20, NetMHCIIpan 21 samt egenutvecklade verktyg som EpiMatrix by EpiVax 22. Likaså har epitop prediktorer nyligen kombineras med andra bioinformatik och molekylära modelleringsverktyg för att ger integrerade protein deimmunization algoritmer som syftar till att minska risken för att deimmunizing mutationer kan störa proteinstruktur och funktion 23-26. Medan flera epitop prediktorer har visat sig vara någorlunda exakt 27,28, beräkningsresultat kräver alltid experimentell validering. Snabb, hög genomströmning och kostnadseffektiva experimentella metoder lämpar sig bäst som en preliminär filter för in silico epitop förutsägelser. På liknande sätt kan epitop prediktorer köra antigen val för omvänd vaccinology 29,30. Till exempel, har framsteg inom bioinformatik gav hela genom skärmar som snabbt identifierar vaccinkandidater i form av hela proteiner eller peptidepitoper extraherade från patogena proteom. Även om detta gör det möjligt för tekniken förändra upptäckten och utvecklingen av skyddande vaccin, införs en ny utmaning i form av intractably stora listor med immunogena vaccinkandidater. Hög genomströmning peptid-MHC II bindningsanalyser kan guida epitop val genom att kvantifiera peptidbindningsaffinitet och bindande promiskuitet bland flera MHC II alleler. Som med protein deimmunization är sådana experimentella metoder i slutändan krävs för att validera beräknings förutsägelse av lovande vaccin leder. Här används en peptid-MHC-II-bindningsanalys skalas till 384-brunnsformat beskrivas. Protokollet är starkt parallelliserad och minskar reagensmedelskostnaderna med 75% jämfört med tidigare beskrivna 96-brunnar format 1,3-5. Med ett och samma liquid hanteringsrobot, tillåter denna metod en forskare att enkelt analysera cirka nittio testpeptider i tre exemplar över ett intervall av åtta koncentrationer och fyra MHC II allel typer i mindre än 48 timmar. I denna artikel beskrivs installationen av en 384-brunnars ELISA-platta för analys av sju experimentella peptider mot en MHC II allel, men spridda räknare ark finns som kompletterande material för att enkelt skala försöket till valfritt antal önskade peptider och / eller MHC Il-molekyler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

Biokemiska analyser med rekombinanta humana MHC II molekyler kan ge snabba, kvantitativa insikter immunogen epitop identifiering, radering eller konstruktion 1,2. Här används en peptid-MHC-II-bindningsanalys skalas till 384-brunnsformat. Den nedskalad protokollet minskar reagenskostnaderna med 75% och är högre kapacitet än tidigare beskrivna 96-håls protokoll 1,3-5. Specifikt den experimentella designen tillåter robust och reproducerbar analys av upp till 15 peptider mot en MHC II allel per 384-brunnars ELISA-platta. Med användning av en enda vätskehanteringsrobot medger denna metod en forskare att analysera ungefär nittio testpeptider i tre exemplar över ett intervall av åtta koncentrationer och fyra MHC II allele typer i mindre än 48 timmar. Andra som arbetar inom områdena protein deimmunization eller vaccin design och utveckling kan finna protokollet för att vara användbara för att underlätta sitt eget arbete. I synnerhet steg-för-steg-instruktioner och visuellt formatav JUPITER bör tillåta andra användare att snabbt och enkelt skapa denna metod i sina egna labb.

Den mogna peptidsekvensen av Enterobacter cloacae P99 beta-laktamas (BLA) (Genbank ID # X07274.1) analyserades med ProPred 16 för förmodade peptid bindemedel till MHC II-allel DRB1 * 1501 (tabell 4). ProPred identifierat 117 nonamer peptider med en obligatorisk P1 ankare rester (dvs M, L, I, V, F, Y eller W i position 1, vilket krävs för MHC II bindning 31). Vid ett tröskelvärde på 5%, peptider endast med poäng större än eller lika med 2,6 är sannolikt ...

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes at JoVE.com

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biokemiska analyser med rekombinanta humana MHC II molekyler kan ge snabba, kvantitativa insikter immunogen epitop identifiering, radering eller design. Här används en peptid-MHC-II-bindningsanalys skalas till 384-brunnsplattor beskrivas. Denna kostnadseffektiva format ska vara användbar när det gäller protein deimmunization och vaccin design och utveckling.

En hög genomströmning MHC II-bindningsanalys för kvantitativ analys av peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Visualisering antigenspecifikt CD4 + T celler med MHC klass II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenes och funktionsanalys av jonkanaler Uttryckt Heterologously i däggdjursceller

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Med hög kapacitet försockringen analys för lignocellulosa

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ Fitness analys Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Hög kapacitet Funktionell Screening med hjälp av en hemmagjord Dual-glöd luciferas analys

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flödescytometrianalyser av Bimolecular Fluorescens Komplettering: En hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-protein interaktion

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Hög genomströmning microinjections av Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...