Name: analysis of rna processing reactions using cell free systems: 3' end cleavage of pre-mrna substrates in vitro
Uploaded: 2014-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro at JoVE.com

SV is dankbaar voor de financiële steun van de NIH K22AI077353 en de Landenberger Foundation. KR zeer erkentelijk voor de financiering van de NIH (5SC1GM083754).

1. Aanpassing van hechtende cellen in suspensie (Deze stap is optioneel. Celsuspensie algemeen beter kernextracten echter cellen gekweekt in platen kunnen ook worden gebruikt.) <ol><li> Pas hechtende cellen voor groei in suspensiekweek met gemodificeerde MEM Joklik, aangevuld met 5-10% kalfsserum pasgeboren of foetale runderserum en 1% L-glutamine: penicilline-streptomycine. Doorvoeren cellen in spinner kolven met een filterdeksel bij 37 ° C met 8% CO2. </li><li> Bij de aanpass...

<ol>
	<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Wahle, E., Ruegsegger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-End+processing+of+pre-mRNA+in+eukaryotes.">3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes.</a> FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).</li><li>Colgan, D. F., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+mRNA+polyadenylation.">Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation.</a> Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA biology. 9, 563-576 (2012).</li><li>Danckwardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prothrombin+3'end+formation+signal+reveals+a+unique+architecture+that+is+sensitive+to+thrombophilic+gain-of-function+mutations.">The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations.</a> Blood. 104, 428-435 (2004).</li><li>Moreira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstream+sequence+element+of+the+C2+complement+poly(A)+signal+activates+mRNA+3'+end+formation+by+two+distinct+mechanisms.">The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms.</a> Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).</li><li>Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+cyclooxygenase-2.">Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2.</a> Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).</li><li>Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+a+basal+polyadenylation+factor+by+the+upstream+sequence+element+of+the+human+lamin+B2+polyadenylation+signal.">Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).</li><li>Moore, C. L., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+cleavage+and+polyadenylation+of+exogenous+RNA+substrate.">Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate.</a> Cell. 41, 845-855 (1985).</li><li>Gilmartin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> mRNA formation and function. , 79-98 (1997).</li><li>Wahle, E., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Processing. Vol. II. , 1-34 (1994).</li><li>Chabot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Processing Vol I. 1, 1-29 (1994).</li><li>Valente, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+mRNA+3'+end+processing+is+distinctively+regulated+by+eIF3f,+CDK11,+and+splice+factor+9G8.">HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8.</a> Mol Cell. 36, 279-289 (2009).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoro-+and+2'-amino-2'-deoxynucleoside+5'-triphosphates+as+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).</li><li>Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+polyadenylation+factor+CPF+specifically+interacts+with+the+pre-mRNA+3'+processing+signal+AAUAAA.">Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA.</a> EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).</li><li>Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+factors+are+required+for+3'-end+cleavage+of+pre-mRNAs.">Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).</li><li>Takagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multisubunit+factor,+CstF,+is+required+for+polyadenylation+of+mammalian+pre-mRNAs.">A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).</li><li>Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pre-mRNA+cleavage+factor+Im+is+related+to+spliceosomal+SR+proteins+and+can+be+reconstituted+in+vitro+from+recombinant+subunits.">Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits.</a> Mol Cell. 1, 243-253 (1998).</li><li>Vries, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pre-mRNA+cleavage+factor+II(m)+contains+homologs+of+yeast+proteins+and+bridges+two+other+cleavage+factors.">Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors.</a> EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).</li><li>Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ordered+pathway+of+assembly+of+components+required+for+polyadenylation+site+recognition+and+processing.">An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing.</a> Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Mol Cell. 33, 365-376 (2009).</li><li>Bentley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+co-transcriptional+recruitment+of+pre-mRNA+processing+factors.">Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+cleavage+and+polyadenylation:+the+long+and+short+of+it.">Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it.</a> Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).</li><li>Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+accurate+and+efficient+mRNA+3'+end+cleavage+and+polyadenylation+of+a+simian+virus+40+early+pre-RNA+in+vitro.">Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro.</a> Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).</li><li>Hirose, Y., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+phosphate,+not+ATP,+is+required+for+3'+end+cleavage+of+mammalian+pre-mRNA+in+vitro.">Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro.</a> J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).</li><li>Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+activators+of+pre-mRNA+3'+cleavage.">Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage.</a> RNA. 15, 483-492 (2009).</li></ol>

De in vitro pre-mRNA 3 &#39;splitsingsreactie, in HeLa cel kernextracten of met splijting factoren gefractioneerd van deze extracten uitgevoerd, is de identificatie van de kern splitsing factoren en hun belangrijkste complexen 16-21 ingeschakeld. Veel meer proteïnen verbonden aan deze factoren zijn nu geïdentificeerd 22, en de in vitro reactie kan verder licht werpen op hoe deze eiwitten teneinde de reactietijd. Misschien omdat de reactie in vivo lijkt cotranscriptional...

De biosynthese van meest volwassen eukaryote bericht RNA (mRNA) vereist een aantal post-transcriptionele modificaties zoals aftopping, splicing en polyadenylatie. Deze modificaties worden doorgaans gekoppeld correcte verwerking 1 waarborgen en sterk de stabiliteit van het mRNA. Het 3 &#39;uiteinde vorming van zoogdieren pre-mRNA wordt gegenereerd door endonucleolytische splitsing van de ontluikende RNA gevolgd door toevoeging van adenylaat residuen aan de 5&#39; gesplitst product door poly (A) polymerase (PAP) 2-4. Bij zoogdieren wordt splitsing uitgevoerd door een multicomponent eiwitcomplex, ongeveer 800 kDa, die assembleert specifieke pre-RNA-sequenties. Het poly (A) signaal sequentie, een sterk geconserveerd canonieke hexa sequentie AAUAAA richt de splitsingsplaats op ongeveer 10-30 nt stroomafwaarts. Deze site is speciaal ontworpen door de splitsing en polyadenylatie specificiteit factor (CPSF) en de 73 kD subunit van erkendeCSPF bevat de endonuclease activiteit. De splitsing stimulatie factor (CstF) bindt een gedegenereerde GU-of U-rijke elementen sequentie stroomafwaarts van het poly (A) plaats. Bovendien is noodzakelijk voor splitsing is het zoogdier splitsing factor I (CFIm) en de zoogdier splitsing factor II (CFII). CFIm bindt de specifieke UGUA (N) sites in stroomopwaartse sequentie-elementen (gebruik) die zijn gedefinieerd voor een aantal genen en lijken betrokken te zijn bij belangrijke fysiologische processen 5-8. In vitro worden RNA processing reacties die gewoonlijk geanalyseerd door het gebruik van radioactief gemerkte RNA substraten 9-12. Deze kunnen worden gesynthetiseerd door run-off transcriptie van de bacteriofaag T7 promoter of SP6. Bij het bestuderen van een polyadenylatieplaats die niet eerder gekarakteriseerd, is het noodzakelijk om genomisch DNA in plaats van cDNA gebruikt om het RNA-substraat genereren belangrijk stroomafwaartse sequenties niet in cDNA kunnen zijn. Ontwerp substraten ten minste 150 nt upstrea omvattenm en 50 nt stroomafwaarts van de splitsingsplaats / einde van het rijpe mRNA. Het splitsingsproduct migreert sneller dan het substraat; Echter, omdat andere fragmenten worden gegenereerd door niet-specifieke nuclease beroep specificiteit van de reactie moet worden gecontroleerd door de afhankelijkheid van de juiste verwerking signaalsequenties. Daarom RNA substraten met een puntmutatie in de sequentie AAUAAA (bijv. AAGAAA) dienen als negatieve controle voor de splitsingreactie. Omdat een kleine hoeveelheid radioactief gemerkt RNA wordt gebruikt voor de splitsingreacties kan RNases aanwezig in hoge overvloed in de meeste nucleaire extracten problematisch zijn, en beperken de keuze van het uitgangsmateriaal voor de bereiding extract. HeLa-cellen hebben de neiging om lage niveaus van endogeen RNases bevatten en dus goed presteren in deze testen. De endonucleolytische splitsing van het RNA substraten in vivo en in vitro wordt onmiddellijk gevolgd door de poly (A) toevoeging, doTussen de gesplitste tussenliggende niet in detecteerbare hoeveelheden. Daarom, om ofwel een specifiek RNA-sequentie of eiwitten betrokken bij een splitsingreactie bestuderen experimenten worden uitgevoerd onder omstandigheden die polyadenylatie voorkomen. Er is geen afhankelijkheid van splitsing op polyadenylatie, of vice versa, zodat men polyadenylering kan stoppen zonder nadelige gevolgen voor het splitsingsreactie. Aldus wordt ATP vervangen door een ketenbeëindigende analoog met de 3-hydroxylgroep mist zodat slechts een enkel nucleotide op de poly (A) site kan worden opgenomen en onder gesplitst RNA kunnen worden gedetecteerd. Gezien de complexiteit en hoge bijzonderheid van dit type test beschrijven we een gedetailleerde video protocol endonucleolytische splitsing bestuderen door de splitsing / poly (A) machines mRNA precursoren in vitro. We beschrijven hoe voor te bereiden bevoegde kernextracten, het genereren van radioactief gemerkt RNA substraten, voeren de splitsingsreactie, en het resultaat analyseren en interpreterening producten. Figuur 1 toont een voorbeeld van substraat RNA codeert voor het 3&#39;-uiteinde van HIV-1 pre-mRNA worden gebruikt voor een klievingsbepaling. Het 3&#39;-uiteinde van de HIV RNA-genoom bestaat uit veel belangrijke regulerende sequenties zoals poly (A) site een G+ U rijk gebied en de USE element dat vereist voor een efficiënte rijping van het virale mRNA-transcripten 13 zijn . In dit voorbeeld zouden we verwachten dat de ingang RNA substraat 338 nt en na splitsing 237 nt zijn. Als polyadenylatie mocht optreden, zou een uitstrijkje van produkten waargenomen tussen 237 en 437 nt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="757">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1L Celstir Flask</td>
			<td style="width:141px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">356884</td>
			<td style="width:281px;">Different sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4 Position Slow Speed Stirrer</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">12621-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Swinging Bucket Centrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:281px;">Allegra x-15R with SX4500 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra Centrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Table Top Centrifuge 5417R</td>
			<td style="width:141px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Refridgerated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermomixer incubator</td>
			<td style="width:141px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250ml Conicle Tubes</td>
			<td style="width:141px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Conicle Tubes</td>
			<td style="width:141px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JOKLIK Modified MEM</td>
			<td style="width:141px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">04-719Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:141px;">Atlas&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-0500-A</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glut:Pen:Strep</td>
			<td style="width:141px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">400-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td style="width:141px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">46-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:141px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:141px;">Alexis Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">280-001-G-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5M Sodium Chloride Solution</td>
			<td style="width:141px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">46-032-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA 0.5M Solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7889-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PMSF</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A702-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cOmplete EDTA-Free Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04 693 132 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">66372</td>
			<td>MWCO 7000 0.5ml-3ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">15ml Dounce Tissue grinder set</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9938-1SET</td>
			<td>Different sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Expand High Fidelity PCR Kit</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 732 650 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10mM dNTP Mix</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Y02256</td>
			<td>10mM each nucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiScript SP6/T7 Kit</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">m7G(5&#39;)ppp(5&#39;) G RNA Cap</td>
			<td style="width:141px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1404S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Century Marker Template Plus</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM7782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easytides UTP [alpha-32p]-250uCi</td>
			<td style="width:141px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU507H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel loading buffer II</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DEPC treated water</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TAE</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:141px;">Ameresco Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">0658-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x PBS</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Acetate</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A637-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycogen</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10 901 393 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100% Absolute Ethanol 200 Proof</td>
			<td style="width:141px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">61509-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acid Phenol-Chloroform</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">9720</td>
			<td>For RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scintilation Fluid</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase Inhibitor</td>
			<td style="width:141px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N261B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly (Vinyl alcohol) PVA</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8136-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine Phosphate</td>
			<td style="width:141px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">2380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100mM dATP</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2560-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:141px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">23042-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1700-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adjustable Sequencing Unit</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351881-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Binder Clips</td>
			<td style="width:141px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">838-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20cmx42cm glass plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352543</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20cmx22cm glass plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35252-7</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20cmx42cm Aluminum Cooling Plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352667</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4mmx22cm Spacers</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35230-6</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4mmx42cm Spacers</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352314-1</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35195-4</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">16-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351962</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">32-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351970</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Repel Coating</td>
			<td style="width:141px;">C.B.S. Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SGR-0401</td>
			<td>or SGR-0101 for individual bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Loading Tips</td>
			<td style="width:141px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">GT-10-4</td>
			<td>0.1-10uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sequencing PowerPac HV</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">PowerPac HV</td>
			<td>5000V/500mA/400W</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Dryer Model 583</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">Model 583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrotech Vacuum Pump for gel dryer</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glogos II Glow-in-the-dark Markers</td>
			<td style="width:141px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Film 8x10</td>
			<td style="width:141px;">Midsci</td>
			<td style="width:119px;">BX810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Film 14x17</td>
			<td style="width:141px;">Phenix</td>
			<td style="width:119px;">F-BX1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Autoradiography Cassette</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FBCA 1417</td>
			<td>8x10 size available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of rna processing reactions using cell free systems: 3' end cleavage of pre-mrna substrates in vitro

Het 3&#39;-uiteinde van zoogdieren mRNA wordt niet gevormd door plotselinge beëindiging van transcriptie door RNA polymerase II (RNPII). In plaats daarvan, RNPII synthetiseert precursor mRNA tot na rijpe RNA, en een actief proces endonuclease activiteit vereist op een bepaalde plek. Splitsing van de voorloper RNA normaal gesproken 10-30 nt stroomafwaarts van de consensus polyA website (AAUAAA) na de CA dinucleotiden. Eiwitten uit de splitsing complex, een multifactoriële eiwitcomplex van ongeveer 800 kDa, doen dit nuclease activiteit. Specifieke RNA-sequenties stroomopwaarts en stroomafwaarts van de polyA site te beheren de werving van de splitsing complex. Onmiddellijk na splitsing, worden pre-mRNA gepolyadenyleerd door de polyA polymerase (PAP) stabiele RNA berichten produceren rijpen. Verwerking van het 3&#39;-uiteinde van een RNA transcript kan worden bestudeerd met behulp van mobiele kernextracten specifieke radioactief gemerkt RNA substraten. Kortom, een lange 32 &lt;/ Sup&gt;-P gelabelde geknipte precursor RNA wordt geïncubeerd met nucleaire extracten in vitro en splitsing wordt beoordeeld door gelelektroforese en autoradiografie. Wanneer de juiste splitsing optreedt, een kortere 5 &#39;gesplitst product wordt gedetecteerd en gekwantificeerd. Hier beschrijven we de klievingsbepaling details met, als voorbeeld, het 3 &#39;uiteinde verwerking van HIV-1 mRNA.

Representatieve resultaten van een assay splitsing van de RNA-poly (A) gebieden van HIV-1 (Figuur 2). We kunnen geknipte RNA-substraat, wat de langzaamste migrerende bij de bovenkant van de gel te observeren. De specifieke gesplitste product de meest intense korter fragment band die sneller in de gel bij de verwachte grootte loopt, en is met name afwezig in de klievingsbepaling van de mutpoly (A) controle dat een punt mutatie in het polyA sequentie (mutPolyA) RNA bevat substraat. Afbraakproducten van de...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro at JoVE.com

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthetiseert een precursor RNA dat buiten de 3 &#39;uiteinde van het rijpe mRNA. Het uiteinde van het rijpe RNA cotranscriptionally gegenereerd op een plaats bepaald door RNA-sequenties, via de endonuclease activiteit van de splitsing complex. Hier hebben we detail de methode om splitsingreacties studeren in vitro.

Analyse van RNA processing Reacties Met behulp van Cell Free Systems: 3 &#39;End Splitsing van pre-mRNA Substrates<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatica Analyse van menselijke embryonale stamcellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualisatie van MG53-gemedieerde celmembraan Reparatie gebruik In vivo En In vitro Systemen

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Single Lees en Gepaarde End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken van 10 nanogram Totaal RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Substraat Generatie voor endonucleasen van CRISPR / Cas Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Eiwitten

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Een Cell Gratis Assay om te studeren Chromatine decondensatie aan het eind van Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detectie van RNA-bindende eiwitten door<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Cultuur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...