Name: analysis of rna processing reactions using cell free systems: 3' end cleavage of pre-mrna substrates in vitro
Uploaded: 2014-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro at JoVE.com

SV는 NIH K22AI077353 및 Landenberger 재단의 자금 지원을위한 감사합니다. KR은 기꺼이 NIH (5SC1GM083754)에서 자금을 인정합니다.

서스펜션에 자기편 세포의 1. 적응 (이것은 선택적인 단계이다. 서스펜션 세포 그러나 일반적으로 접시에서 자란 세포가 또한 사용될 수있다 나은 핵 추출물을 만든다.) <ol><li> 페니실린 스트렙토 마이신 : 5 ~ 10 %의 신생아 혈청 또는 소 태아 혈청과 1 %의 L-글루타민 Joklik의 수정 MEM을 사용하여 서스펜션의 성장에 부착 세포를 적응. 8 % CO 2와 37 ° C에서 필터 캡 스피너...

<ol>
	<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Wahle, E., Ruegsegger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-End+processing+of+pre-mRNA+in+eukaryotes.">3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes.</a> FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).</li><li>Colgan, D. F., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+mRNA+polyadenylation.">Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation.</a> Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA biology. 9, 563-576 (2012).</li><li>Danckwardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prothrombin+3'end+formation+signal+reveals+a+unique+architecture+that+is+sensitive+to+thrombophilic+gain-of-function+mutations.">The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations.</a> Blood. 104, 428-435 (2004).</li><li>Moreira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstream+sequence+element+of+the+C2+complement+poly(A)+signal+activates+mRNA+3'+end+formation+by+two+distinct+mechanisms.">The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms.</a> Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).</li><li>Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+cyclooxygenase-2.">Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2.</a> Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).</li><li>Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+a+basal+polyadenylation+factor+by+the+upstream+sequence+element+of+the+human+lamin+B2+polyadenylation+signal.">Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).</li><li>Moore, C. L., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+cleavage+and+polyadenylation+of+exogenous+RNA+substrate.">Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate.</a> Cell. 41, 845-855 (1985).</li><li>Gilmartin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> mRNA formation and function. , 79-98 (1997).</li><li>Wahle, E., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Processing. Vol. II. , 1-34 (1994).</li><li>Chabot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Processing Vol I. 1, 1-29 (1994).</li><li>Valente, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+mRNA+3'+end+processing+is+distinctively+regulated+by+eIF3f,+CDK11,+and+splice+factor+9G8.">HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8.</a> Mol Cell. 36, 279-289 (2009).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoro-+and+2'-amino-2'-deoxynucleoside+5'-triphosphates+as+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).</li><li>Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+polyadenylation+factor+CPF+specifically+interacts+with+the+pre-mRNA+3'+processing+signal+AAUAAA.">Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA.</a> EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).</li><li>Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+factors+are+required+for+3'-end+cleavage+of+pre-mRNAs.">Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).</li><li>Takagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multisubunit+factor,+CstF,+is+required+for+polyadenylation+of+mammalian+pre-mRNAs.">A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).</li><li>Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pre-mRNA+cleavage+factor+Im+is+related+to+spliceosomal+SR+proteins+and+can+be+reconstituted+in+vitro+from+recombinant+subunits.">Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits.</a> Mol Cell. 1, 243-253 (1998).</li><li>Vries, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pre-mRNA+cleavage+factor+II(m)+contains+homologs+of+yeast+proteins+and+bridges+two+other+cleavage+factors.">Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors.</a> EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).</li><li>Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ordered+pathway+of+assembly+of+components+required+for+polyadenylation+site+recognition+and+processing.">An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing.</a> Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Mol Cell. 33, 365-376 (2009).</li><li>Bentley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+co-transcriptional+recruitment+of+pre-mRNA+processing+factors.">Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+cleavage+and+polyadenylation:+the+long+and+short+of+it.">Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it.</a> Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).</li><li>Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+accurate+and+efficient+mRNA+3'+end+cleavage+and+polyadenylation+of+a+simian+virus+40+early+pre-RNA+in+vitro.">Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro.</a> Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).</li><li>Hirose, Y., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+phosphate,+not+ATP,+is+required+for+3'+end+cleavage+of+mammalian+pre-mRNA+in+vitro.">Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro.</a> J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).</li><li>Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+activators+of+pre-mRNA+3'+cleavage.">Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage.</a> RNA. 15, 483-492 (2009).</li></ol>

헬라 세포 핵 추출물 또는이 추출물로부터 분획 분열의 요인으로 수행 체외 사전 mRNA의 3 &#39;분열 반응은, 핵심 분열 요인과 그들의 주요 단지 16-21의 식별을 가능하게했다. 이러한 요인과 관련된 더 많은 단백질은 최근 22 확인 된, 그리고 생체 반응은이 단백질이 반응에 기여하는 방법에 있나을 계속할 수있다. 생체 내에서의 반응은 23 cotranscriptional 것...

가장 성숙한 진핵 메시지 RNA를 (의 mRNA)의 생합성은 모자를 씌우는, 접합 및 폴리아 데 닐화 등 여러 가지 전사 후 수정이 필요합니다. 이러한 수정은 일반적으로 올바른 처리 한되도록 강하게의 mRNA의 안정성을 증가시키기 위해 결합된다. 3 &#39;포유류 사전의 mRNA의 최종 형성을 5 아데 닐 잔기 첨가하여 초기 RNA endonucleolytic의 절단에 의해 생성 된&#39;폴리 (A) 중합 효소 (PAP) 2-4해서 제품을 절단. 포유 동물에서, 분열 특정 사전 RNA 서열에 조립 약 800 kDa의,의, 다 성분 단백질 복합체에 의해 달성된다. 폴리 (A) 신호 순서, 고도 보존 정식 hexanucleotide 시퀀스 AAUAAA은 약 10 ~ 30 NT 하류의 절단 부위를 지시합니다. 이 사이트는 특히 절단 및 폴리아 데 닐화 특이 요인 (CPSF) 및 73 kD의 서브 유닛에 의해 인식CSPF는 효소의 활동이 포함되어 있습니다. 분열 자극 인자 (인 CstF)는 다운 스트림 폴리 (A) 사이트의 더 퇴화 GU-또는 U 풍부한 요소 순서를 결합한다. 또한 포유류의 분열 인자 I (CFIm), 및 포유류의 분열 요인 II (CFII)을 절단입니다이 필요합니다. CFIm 유전자의 수에 대해 정의하고 중요한 생리적 과정 5-8에 관여하는 것으로 보인다 된 상류 시퀀스 요소 (사용)에서 특정 UGUA (N) 사이트를 바인딩합니다. 시험관 내에서, RNA 프로세싱 반응은 일반적으로 방사성 표지 된 RNA 9-12 기판의 사용에 의해 분석된다. 이들은 박테리오파지 프로모터 T7 또는 SP6에서 실행 오프 전사에 의해 합성 될 수있다. 이전 특징으로되지 않은 폴리아 데 닐화 사이트를 연구 할 때, 중요한 하류 서열의 cDNA에 존재하지 않을 수도로서, RNA 기질을 생성하는 게놈 DNA가 아닌하는 cDNA를 사용하는 것이 필요하다. 적어도 150 NT를 upstrea를 포함하도록 설계 기판m 50 NT 하류 성숙한 mRNA의의 분열 사이트 / 끝에서. 분열 생성물은 기판보다 빠르게 마이그레이션; 다른 단편은 비특이적 핵산 분해 효소 작용에 의해 생성 될 수 있기 때문에, 반응의 특이성은 올바른 처리 신호 계열에 대한 의존도에 의해 확인되어야한다. 따라서, AAUAAA 순서 (예를 들면 AAGAAA)에 점 돌연변이를 가진 RNA의 기판 절단 반응에 대한 부정적인 제어 역할을합니다. 방사성 표지 된 RNA의 소량의 절단 반응에 사용되는 것을 감안할 때, 대부분의 핵 추출물에서 높은 풍부 본 RNases 문제가 될하고 추출물 제조를위한 출발 물질의 선택을 제한 할 수있다. 헬라 세포는 내생 RNases의 낮은 수준을 포함​​, 따라서 이러한 분석에서 잘 수행하는 경향이있다. 생체 내 및 시험 관내에서 RNA 기판의 endonucleolytic 분열은 바로 폴리 (A)뿐만 아니라, 목 뒤에있다의 쪼개진 중간이 검출 수량에 존재하지 않습니다. 따라서, 특정 RNA 서열 또는 절단 반응에 관여하는 단백질 중 하나를 연구하기 위해 실험을 발생 폴리아 데 닐화를 방지 조건에서 수행됩니다. 하나는 분열 반응을 해치지 않고 폴리아 데 닐화를 중지 할 수 있도록 더 폴리아 데 닐화에 분열의 의존성, 또는 그 반대는 없다. 따라서, ATP는 단일 염기는 폴리 (A) 위치에서 통합 될 수 있으며, 단지 절단 RNA를 검출 할 수 있도록 3 &#39;히드록시기 결여 사슬 종결 유사체로 대체된다. 복잡성과 분석이 유형의 특수성 높은 수준을 감안할 때, 우리는 체외에서 mRNA의 전구체의 절단 / 폴리 (A) 기계에 의해 endonucleolytic 분열을 공부 자세한 설명을 동영상 프로토콜을 설명합니다. 우리는, 관할 핵 추출물을 제조 방사성 표지 RNA 기질을 생성, 분열 반응을 수행하고, 그 결과를 분석하고 해석하는 방법을 설명보내고 제품.도 1은 분해 분석에 사용되는 HIV-1 이전의 mRNA의 3 &#39;말단에 대해 코딩하는 RNA를 기판의 일례를 나타낸다. HIV의 RNA 게놈의 3 &#39;말단은 예컨대 폴리 (A)의 사이트, G+ U 리치 영역 및 모든 바이러스의 mRNA 전 사체 (13)의 효율적인 숙성에 필요한 USE 소자 등 많은 중요한 조절 서열로 구성된다 . 이 예에서 우리는 입력 RNA 기판은 338 NT 및 분열 237에 NT 것으로 기대합니다. 폴리아 데 닐화이 발생하도록 허용 된 경우, 제품의 얼룩은 237과 437 NT 사이에서 관찰된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="757">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1L Celstir Flask</td>
			<td style="width:141px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">356884</td>
			<td style="width:281px;">Different sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4 Position Slow Speed Stirrer</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">12621-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Swinging Bucket Centrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:281px;">Allegra x-15R with SX4500 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra Centrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Table Top Centrifuge 5417R</td>
			<td style="width:141px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Refridgerated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermomixer incubator</td>
			<td style="width:141px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250ml Conicle Tubes</td>
			<td style="width:141px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Conicle Tubes</td>
			<td style="width:141px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JOKLIK Modified MEM</td>
			<td style="width:141px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">04-719Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:141px;">Atlas&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-0500-A</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glut:Pen:Strep</td>
			<td style="width:141px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">400-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td style="width:141px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">46-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:141px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:141px;">Alexis Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">280-001-G-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5M Sodium Chloride Solution</td>
			<td style="width:141px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">46-032-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA 0.5M Solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7889-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PMSF</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A702-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cOmplete EDTA-Free Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04 693 132 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">66372</td>
			<td>MWCO 7000 0.5ml-3ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">15ml Dounce Tissue grinder set</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9938-1SET</td>
			<td>Different sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Expand High Fidelity PCR Kit</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 732 650 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10mM dNTP Mix</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Y02256</td>
			<td>10mM each nucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiScript SP6/T7 Kit</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">m7G(5&#39;)ppp(5&#39;) G RNA Cap</td>
			<td style="width:141px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1404S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Century Marker Template Plus</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM7782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easytides UTP [alpha-32p]-250uCi</td>
			<td style="width:141px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU507H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel loading buffer II</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DEPC treated water</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TAE</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:141px;">Ameresco Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">0658-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x PBS</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Acetate</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A637-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycogen</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10 901 393 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100% Absolute Ethanol 200 Proof</td>
			<td style="width:141px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">61509-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acid Phenol-Chloroform</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">9720</td>
			<td>For RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scintilation Fluid</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase Inhibitor</td>
			<td style="width:141px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N261B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly (Vinyl alcohol) PVA</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8136-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine Phosphate</td>
			<td style="width:141px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">2380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100mM dATP</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2560-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:141px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">23042-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1700-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adjustable Sequencing Unit</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351881-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Binder Clips</td>
			<td style="width:141px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">838-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20cmx42cm glass plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352543</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20cmx22cm glass plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35252-7</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20cmx42cm Aluminum Cooling Plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352667</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4mmx22cm Spacers</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35230-6</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4mmx42cm Spacers</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352314-1</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35195-4</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">16-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351962</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">32-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351970</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Repel Coating</td>
			<td style="width:141px;">C.B.S. Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SGR-0401</td>
			<td>or SGR-0101 for individual bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Loading Tips</td>
			<td style="width:141px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">GT-10-4</td>
			<td>0.1-10uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sequencing PowerPac HV</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">PowerPac HV</td>
			<td>5000V/500mA/400W</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Dryer Model 583</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">Model 583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrotech Vacuum Pump for gel dryer</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glogos II Glow-in-the-dark Markers</td>
			<td style="width:141px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Film 8x10</td>
			<td style="width:141px;">Midsci</td>
			<td style="width:119px;">BX810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Film 14x17</td>
			<td style="width:141px;">Phenix</td>
			<td style="width:119px;">F-BX1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Autoradiography Cassette</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FBCA 1417</td>
			<td>8x10 size available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of rna processing reactions using cell free systems: 3' end cleavage of pre-mrna substrates in vitro

포유 동물의 mRNA의 3 &#39;끝은 RNA 중합 효소 II (RNPII)에 의해 전사의 갑작스러운 종료에 의해 형성되지 않는다. 대신 RNPII 성숙 RNA를 끝 뒤 전구체의 mRNA를 합성하고, 효소 활성의 활성 프로세스가 특정 사이트에서 요구된다. 전구체 RNA의 절단은 일반적으로 CA 디 뉴클레오티드 후 합의 폴리 A 사이트 (AAUAAA)에서 다운 스트림 NT 10-30을 발생합니다. 절단 단지, 약 800 kDa의의 인성 단백질 복합체의 단백질이 특정 핵산 분해 효소의 활동을 수행. 특정 RNA 서열은 상류와 폴리 A 사이트의 하류 절단 단지의 모집을 제어 할 수 있습니다. 즉시 절단 후, 사전의 mRNA는 성숙 안정 RNA 메시지를 생산하는 폴리 A 중합 효소 (PAP)에 의해 폴리아 데 닐화됩니다. RNA 전 사체의 3 &#39;말단의 처리는 특정 방사성 동위 원소 표지 된 RNA 기판으로 세포의 핵 추출물을 사용하여 연구 할 수있다. 요컨대, 긴 32 &lt;/ SUP&gt; P-표지 uncleaved 전구체 RNA는 시험 관내에서 핵 추출물과 함께 배양하고, 절단은 겔 전기 영동 및 오토 라디오 그래피에 의해 평가된다. 적절한 분열이 발생하면 &#39;5 짧은 제품이 감지 및 정량화 절단. 여기서는, 예를 들어, 사용 상세히 HIV-1의 mRNA의 3 &#39;말단 처리를 절단 분석을 기술한다.

RNA 폴리 (A) HIV-1의 사이트 (그림 2)의 분해 분석의 대표 결과. 우리는 젤의 상단에 가장 느린 이주 밴드 uncleaved RNA 기판을 관찰 할 수 있습니다. 구체적인 절단 된 제품은 빠른 예상 크기의 겔에서 실행 가장 강렬한 짧은 단편 밴드이며, 폴리 A 서열 (mutPolyA) RNA의 점 돌연변이를 포함 mutpoly (A) 제어의 분열 분석에서 특히 결석 기판. 입력 기판의 분해 생성물이 때때로 관찰된다. 분열 활성?...

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Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA 중합 효소 II는 성숙의 mRNA의 3 &#39;말단 확장되는 전구체 RNA를 합성한다. 성숙한 RNA의 끝은 절단 복합체의 효소 활동을 통해 RNA 염기 서열에 의해 결정 사이트에서 cotranscriptionally 생성됩니다. 여기에 세부 사항에게 체외에서 분열 반응을 연구하는 방법을 우리는.

사전 mRNA의 기판의 3 &#39;끝 분열 : 휴대폰 무료 시스템을 사용하여 RNA 가공 반응 분석<em&gt; 시험관</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

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Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

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