Name: analysis of rna processing reactions using cell free systems: 3' end cleavage of pre-mrna substrates in vitro
Uploaded: 2014-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro at JoVE.com

SV är tacksam för finansiering stöd från NIH K22AI077353 och Landenberger Foundation. KR tacksam finansiering från NIH (5SC1GM083754).

1. Anpassning av Vidhäftande Cells in Suspension (Detta är ett valfritt steg. Suspensionsceller göra generellt bättre nukleära extrakt emellertid celler odlade i plattor kan också användas.) <ol><li> Adapt adherenta celler för tillväxt i suspension med användning Joklik modifierade MEM kompletterat med 5 till 10% serum från nyfödd kalv eller fetalt bovint serum och 1% L-glutamin: penicillin-streptomycin. Sprid-celler i spinnerflaskor med ett filterlock vid 37 ° C med 8% C...

<ol>
	<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Wahle, E., Ruegsegger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-End+processing+of+pre-mRNA+in+eukaryotes.">3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes.</a> FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).</li><li>Colgan, D. F., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+mRNA+polyadenylation.">Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation.</a> Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA biology. 9, 563-576 (2012).</li><li>Danckwardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prothrombin+3'end+formation+signal+reveals+a+unique+architecture+that+is+sensitive+to+thrombophilic+gain-of-function+mutations.">The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations.</a> Blood. 104, 428-435 (2004).</li><li>Moreira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstream+sequence+element+of+the+C2+complement+poly(A)+signal+activates+mRNA+3'+end+formation+by+two+distinct+mechanisms.">The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms.</a> Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).</li><li>Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+cyclooxygenase-2.">Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2.</a> Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).</li><li>Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+a+basal+polyadenylation+factor+by+the+upstream+sequence+element+of+the+human+lamin+B2+polyadenylation+signal.">Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).</li><li>Moore, C. L., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+cleavage+and+polyadenylation+of+exogenous+RNA+substrate.">Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate.</a> Cell. 41, 845-855 (1985).</li><li>Gilmartin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> mRNA formation and function. , 79-98 (1997).</li><li>Wahle, E., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Processing. Vol. II. , 1-34 (1994).</li><li>Chabot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Processing Vol I. 1, 1-29 (1994).</li><li>Valente, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+mRNA+3'+end+processing+is+distinctively+regulated+by+eIF3f,+CDK11,+and+splice+factor+9G8.">HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8.</a> Mol Cell. 36, 279-289 (2009).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoro-+and+2'-amino-2'-deoxynucleoside+5'-triphosphates+as+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).</li><li>Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+polyadenylation+factor+CPF+specifically+interacts+with+the+pre-mRNA+3'+processing+signal+AAUAAA.">Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA.</a> EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).</li><li>Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+factors+are+required+for+3'-end+cleavage+of+pre-mRNAs.">Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).</li><li>Takagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multisubunit+factor,+CstF,+is+required+for+polyadenylation+of+mammalian+pre-mRNAs.">A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).</li><li>Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pre-mRNA+cleavage+factor+Im+is+related+to+spliceosomal+SR+proteins+and+can+be+reconstituted+in+vitro+from+recombinant+subunits.">Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits.</a> Mol Cell. 1, 243-253 (1998).</li><li>Vries, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pre-mRNA+cleavage+factor+II(m)+contains+homologs+of+yeast+proteins+and+bridges+two+other+cleavage+factors.">Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors.</a> EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).</li><li>Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ordered+pathway+of+assembly+of+components+required+for+polyadenylation+site+recognition+and+processing.">An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing.</a> Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Mol Cell. 33, 365-376 (2009).</li><li>Bentley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+co-transcriptional+recruitment+of+pre-mRNA+processing+factors.">Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+cleavage+and+polyadenylation:+the+long+and+short+of+it.">Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it.</a> Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).</li><li>Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+accurate+and+efficient+mRNA+3'+end+cleavage+and+polyadenylation+of+a+simian+virus+40+early+pre-RNA+in+vitro.">Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro.</a> Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).</li><li>Hirose, Y., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+phosphate,+not+ATP,+is+required+for+3'+end+cleavage+of+mammalian+pre-mRNA+in+vitro.">Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro.</a> J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).</li><li>Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+activators+of+pre-mRNA+3'+cleavage.">Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage.</a> RNA. 15, 483-492 (2009).</li></ol>

In vitro-pre-mRNA 3 &#39;klyvningsreaktion, genomförs i HeLa cellkärnextrakt eller med klyvningsfaktorer fraktione från dessa extrakt, har möjliggjort identifiering av kärnklyvnings faktorer och deras huvudkomplex 16-21. Många fler proteiner associerade med dessa faktorer har nyligen identifierats 22, och in vitro-reaktion kan fortsätta att belysa hur dessa proteiner bidrar till reaktionen. Kanske för att reaktionen in vivo förefaller vara cotranscriptional ...

Biosyntesen av de flesta mogna eukaryota meddelande RNA (mRNA) kräver flera post-transkriptionella modifieringar såsom tak, splitsning och polyadenylering. Dessa modifieringar är i allmänhet kopplad för att säkerställa korrekt bearbetning 1 och starkt öka stabiliteten hos mRNA. Den 3 &#39;-änden bildande av däggdjurs pre-mRNA-molekyler genereras genom endonukleolytisk klyvning av begynnande RNA följt av tillsats av adenylat rester till 5&#39;spaltas genom poly (A) polymeras (PAP) 2-4. Hos däggdjur är klyvning uppnås genom en flerproteinkomplex, på cirka 800 kDa, som monterar på specifika pre-RNA-sekvenser. Poly (A)-signalsekvens, en mycket konserverad kanoniska hexanukleotid sekvens AAUAAA, riktar klyvningsstället vid ungefär 10 till 30 nt nedströms. Denna webbplats är uttryckligen erkänts av klyvning och polyadenylering specificitet faktor (CPSF) och 73 kD subenheten avCSPF innehåller endonukleasaktiviteten. Klyvningen stimulering faktor (CstF) binder en mer degenererad GU-eller U-rika elementet sekvens nedströms om poly (A)-ställe. Dessutom behövs för klyvning är däggdjurs klyvning faktor I (CFIm) och däggdjurs klyvning faktor II (CFII). CFIm binder de specifika UGUA (N) platser i uppströmssekvenselement (användningar) som har definierats för ett antal gener och verkar vara involverade i viktiga fysiologiska processer 5-8. In vitro, är RNA-bearbetningsreaktioner vanligen analyseras genom användning av radiomärkta RNA-substrat 9-12. Dessa kan syntetiseras genom avrinning transkription från bakteriofag promotor T7 eller SP6. När man studerar ett polyadenyleringsställe som inte har karakteriserats tidigare, är det nödvändigt att använda genomiskt DNA i stället för cDNA för att generera RNA-substrat, såsom viktiga nedströms sekvenser som inte kan förekomma i cDNA. Design substrat för att omfatta minst 150 nt upstream och 50 nt nedströms från klyvningsstället / slutet på den mogna mRNA. Klyvningsprodukten migrerar snabbare än substratet; men eftersom andra fragment kan genereras genom icke-specifik nukleas åtgärd, har specificitet reaktionen som kontrolleras av dess beroende av rätt behandling signalsekvenserna. Därför RNA-substrat med en punktmutation i AAUAAA-sekvens (t.ex. AAGAAA) tjänar som en negativ kontroll för klyvningsreaktionen. Med tanke på att en liten mängd av radioaktivt märkt RNA som används för klyvningsreaktioner kan RNaser som förekommer rikligt i de flesta nukleära extrakt vara problematiskt, och begränsa valet av utgångsmaterial för extraktpreparat. HeLa-celler som tenderar att innehålla låga nivåer av endogena RNaser och sålunda fungera väl i dessa analyser. Den endonukleolytisk klyvning av RNA-substrat in vivo och in vitro omedelbart följs av poly (A)-addition, torser det kluvna intermediär inte är närvarande i detekterbara mängder. Därför, för att studera antingen en specifik RNA-sekvens eller proteiner involverade i en klyvningsreaktion, är experiment utförs under förhållanden som förhindrar polyadenylation uppstår. Det finns inget beroende av klyvning på polyadenylering, eller vice versa, så att en kan stoppa polyadenylering utan att skada klyvningsreaktionen. Således är ATP ersattes med en kedjeterminerande analog som saknar 3&#39;-hydroxylgruppen så att endast en enda nukleotid kan inkorporeras vid den poly (A)-ställe och bara spjälkas RNA kan detekteras. Med tanke på komplexiteten och hög grad av speciella med denna typ av analys, beskriver vi en detaljerad video-protokoll för att studera endonukleolytisk klyvning av klyvning / Poly (A) maskiner av mRNA-prekursorer in vitro. Vi beskriver hur man förbereder kompetenta kärnextrakt, genererar radiomärkta RNA-substrat, utföra klyvningsreaktionen, och analysera och tolka resultateting produkter. Figur 1 visar ett exempel på substrat-RNA som kodar för 3&#39;-änden av HIV-1 pre-mRNA: n som skall användas för ett klyvningsanalys. Den 3 &#39;-änden av HIV-RNA-genomet är sammansatt av många viktiga reglerande sekvenser, såsom poly (A)-ställe, ett G+ U rik region, och användningen elementet, som alla är nödvändiga för effektiv mognad av de virala mRNA-transkript 13 . I det här exemplet skulle vi förvänta oss den ingående RNA-substrat att vara 338 nt och vid klyvning 237 nt. Om polyadenylering fick ske, skulle observeras ett utstryk av produkter mellan 237 och 437 nt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="757">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1L Celstir Flask</td>
			<td style="width:141px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">356884</td>
			<td style="width:281px;">Different sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4 Position Slow Speed Stirrer</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">12621-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Swinging Bucket Centrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:281px;">Allegra x-15R with SX4500 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra Centrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Table Top Centrifuge 5417R</td>
			<td style="width:141px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Refridgerated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermomixer incubator</td>
			<td style="width:141px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250ml Conicle Tubes</td>
			<td style="width:141px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Conicle Tubes</td>
			<td style="width:141px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JOKLIK Modified MEM</td>
			<td style="width:141px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">04-719Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:141px;">Atlas&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-0500-A</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glut:Pen:Strep</td>
			<td style="width:141px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">400-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td style="width:141px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">46-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:141px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">194844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:141px;">Alexis Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">280-001-G-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5M Sodium Chloride Solution</td>
			<td style="width:141px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">46-032-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA 0.5M Solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7889-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PMSF</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A702-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cOmplete EDTA-Free Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04 693 132 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">66372</td>
			<td>MWCO 7000 0.5ml-3ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">15ml Dounce Tissue grinder set</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9938-1SET</td>
			<td>Different sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Expand High Fidelity PCR Kit</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 732 650 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10mM dNTP Mix</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Y02256</td>
			<td>10mM each nucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiScript SP6/T7 Kit</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">m7G(5&#39;)ppp(5&#39;) G RNA Cap</td>
			<td style="width:141px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1404S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Century Marker Template Plus</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM7782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easytides UTP [alpha-32p]-250uCi</td>
			<td style="width:141px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU507H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel loading buffer II</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">8546G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DEPC treated water</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TAE</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:141px;">Ameresco Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">0658-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x PBS</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Acetate</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A637-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycogen</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10 901 393 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100% Absolute Ethanol 200 Proof</td>
			<td style="width:141px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">61509-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acid Phenol-Chloroform</td>
			<td style="width:141px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">9720</td>
			<td>For RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scintilation Fluid</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SX18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase Inhibitor</td>
			<td style="width:141px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N261B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly (Vinyl alcohol) PVA</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8136-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine Phosphate</td>
			<td style="width:141px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">2380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100mM dATP</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2560-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:141px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">23042-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1700-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adjustable Sequencing Unit</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351881-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Binder Clips</td>
			<td style="width:141px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">838-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20cmx42cm glass plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352543</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20cmx22cm glass plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35252-7</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20cmx42cm Aluminum Cooling Plates</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352667</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4mmx22cm Spacers</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35230-6</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4mmx42cm Spacers</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z352314-1</td>
			<td>1SET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z35195-4</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">16-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351962</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">32-well Comb</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z351970</td>
			<td>1EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Repel Coating</td>
			<td style="width:141px;">C.B.S. Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SGR-0401</td>
			<td>or SGR-0101 for individual bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Loading Tips</td>
			<td style="width:141px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">GT-10-4</td>
			<td>0.1-10uL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sequencing PowerPac HV</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">PowerPac HV</td>
			<td>5000V/500mA/400W</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel Dryer Model 583</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">Model 583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrotech Vacuum Pump for gel dryer</td>
			<td style="width:141px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glogos II Glow-in-the-dark Markers</td>
			<td style="width:141px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Film 8x10</td>
			<td style="width:141px;">Midsci</td>
			<td style="width:119px;">BX810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Film 14x17</td>
			<td style="width:141px;">Phenix</td>
			<td style="width:119px;">F-BX1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Autoradiography Cassette</td>
			<td style="width:141px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FBCA 1417</td>
			<td>8x10 size available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of rna processing reactions using cell free systems: 3' end cleavage of pre-mrna substrates in vitro

Den 3 &#39;-änden av däggdjurs-mRNA bildas inte genom abrupt avbrytande av transkription genom RNA-polymeras II (RNPII). Istället RNPII syntetiserar gångaren mRNA längre än till slutet av mogna RNA, och en aktiv process av endonukleasaktivitet krävs vid en viss plats. Klyvning av prekursor-RNA sker normalt 10-30 nt nedströms från konsensus polyA webbplats (AAUAAA) efter CA dinukleotiderna. Proteiner från klyvningskomplex, en multifaktoriell proteinkomplex av ungefär 800 kDa, utföra denna specifika nukleasaktivitet. Specifika RNA-sekvenser uppströms och nedströms om polyA-stället styra rekrytering av klyvningskomplex. Omedelbart efter klyvning, är pre-mRNA polyadenyleras av polyA polymeras (PAP) för att producera mogna stabila RNA-meddelanden. Bearbetning av 3&#39;-änden av en RNA-transkript kan studeras med användning av cellkärnextrakt med specifika radiomärkta RNA-substrat. Sammanfattningsvis, en lång 32 &lt;/ Sup&gt; P-märkt ej kluven prekursor RNA inkuberas med nukleära extrakt in vitro, och klyvning bedöms genom gelelektrofores och autoradiografi. När korrekt klyvning sker, en kortare 5 &#39;kluvna produkt upptäcks och kvantifieras. Här beskriver vi klyvningsanalys i detalj med hjälp av, som ett exempel, 3&#39;-änden behandling av HIV-1-mRNA.

Representativa resultat av en klyvningsanalys av RNA-poly (A) områden av HIV-1 (figur 2). Vi kan observera det okluvna RNA-substrat, som är långsammast vandrande band på toppen av gelén. Den specifika avskiljda produkten är den mest intensiva kortare fragmentet band som går snabbare i gelén vid den förväntade storleken, och är specifikt frånvarande från klyvning analysen enligt mutpoly (A) kontroll som innehåller en punktmutation i polyA-sekvens (mutPolyA)-RNA substrat. Nedbrytningsprodukt...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro at JoVE.com

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA-polymeras II syntetiserar en prekursor RNA, som sträcker sig förbi 3&#39;-änden av det mogna mRNA. Änden av den mogna RNA genereras cotranscriptionally, vid ett ställe som dikteras av RNA-sekvenser, via endonukleasaktiviteten av klyvningskomplex. Här har vi detaljerat förfarandet för att studera klyvningsreaktioner in vitro.

Analys av RNA Processing Reaktioner Använda Cell Free Systems: 3 &#39;End Cleavage av Pre-mRNA-substrat<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatik Analys av mänskliga embryonala stamceller Colony Tillväxt

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualisering av MG53-medierad cellmembranet reparera med hjälp av In vivo Och In vitro System

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Enstaka Läs och Paired End-mRNA-Seq Illumina bibliotek från 10 nanogram Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transkription och begränsning av Gaussia Luciferas mRNA Följt av HeLa celltransfektion

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell särskild analys av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blad Använda fluorescensaktiverad cellsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Substrat för skapandet endonukleaser av CRISPR / CAS Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Metabolisk märkning av nyligen transkriberade RNA för högupplöst profilering av genuttryck för RNA syntes, bearbetning och förfall i cellkultur

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

HeLa Baserat Cell yttrandefriheten System för uttryck av<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

En cell gratis analys för att studera Chromatin Decondensation vid slutet av Mitos

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detektering av RNA-bindande proteiner genom<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA List i fettceller kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...