Name: three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells
Uploaded: 2014-04-25T14:45:00
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Ce travail a été financé par des subventions du NIH R01 CA107469, CA125577 R01, et U01CA154224 CG Kleer, l&#39;Université du Centre de soutien de cancer du Michigan.

1. Préparation du matériel et de la culture des médias <ol><li> Facteur de croissance dégel réduite (GFR) Matrigel à 4 ° CO / N. </li><li> Réchauffez médias complètes pour la lignée cellulaire nécessaire à 37 ° C. MCF10A-ATCC spécifié médias; F-12 du milieu de HME-Ham supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal, 1 ug / ml d&#39;hydrocortisone, 5 ng / ml d&#39;insuline, 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique, et la toxine du choléra 100 ng / ml; F-12 les médias SUM 149-Ham additionné de...

<ol>
	<li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+in+breast+development+and+disease.">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. 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P., Rosen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosen's breast pathology. , (2008).</li><li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay.">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li><li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1/p38+pathway,+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer.">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li><li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-&#946;+receptor.">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-&#946; receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts.">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth,+progression,+and+metastasis+to+bone.">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li><li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells.">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li><li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes.">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li></ol>

Nous avons décrit ici la culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée, et l&#39;utilité de ce système par rapport à la différence entre le phénotype malin bénigne du sein. Ce système peut également être utilisé pour la culture de différents types à partir d&#39;autres tissus glandulaires cellulaires et a été rapporté comme ayant été utilisé avec succès pour la culture épithéliale prostatique, l&#39;épithélium bronchique, et les cellules épi...

Trois culture tridimensionnelle (3D) de cellules épithéliales mammaires sur la membrane basale reconstituée est un important système modèle pour étudier le phénotype et le complexe de signalisation associée sein normal et le cancer du sein 2,3. L&#39;unité fonctionnelle du sein est l&#39;unité lobulaire conduit terminal (TDLU) qui se compose d&#39;un petit conduit qui se ramifie en acini. Les acini sont des structures hautement organisées, composées de deux couches de cellules, les cellules épithéliales et myoépithéliales, qui sont entourés par une membrane basale 5. Les caractéristiques les plus distinctives des acini normaux sont polarisation cellulaire, l&#39;attachement à la membrane basale sous-jacente et les contacts cellule-cellule spécialisés. Cette organisation complexe est perturbé dans les carcinomes invasifs. Les cultures 2D largement utilisés, où les cellules sont cultivées en monocouche, ne permettent pas la formation d&#39;acini. Ainsi, la culture monocouche manque en proposant un système pour capturer la relation complexe entre les cellules épithélialesdans le sein normal et leur dérégulation dans le cancer du sein. Cultures épithéliales monotypique fonctionnelles des cellules mammaires ont été développés dans plusieurs laboratoires 2,3. Culture 3D implique la croissance des cellules mammaires sur Matrigel, qui est un extrait solubilisé dérivé de cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm et est disponible dans le commerce. D&#39;autres substrats 3D comme le collagène I sont également utilisés. Les cellules du sein peuvent être cultivées en 3D 3D par dosage incorporé, où les cellules sont mises en culture dans du Matrigel embarqué 2. Alternativement, les cellules peuvent être cultivées en 3D sur test, aussi appelé test de superposition 3D, qui est rentable car elle nécessite moins de volume de Matrigel et facilite la surveillance en temps de déchéance de la formation de colonies par imagerie à contraste de phase et est idéal pour l&#39;imagerie in situ 2 -3. Le 3D-dessus essai a été utilisé pour définir la corrélation entre le phénotype et acineuses profil d&#39;expression génique 7. Culture 3D peut être effectively utilisé pour distinguer les cellules normales et bénignes de cancer invasif. Les cellules normales et bénignes du sein constituent croissance arrêté structures polarisées avec une lumière bien définis dans le centre sur Matrigel tandis que les cellules de carcinome invasif poussent abondamment et au hasard sans compensation de la lumière. E6/E7 immortalisé des cellules épithéliales mammaires humaines et lignée cellulaire MCF10A, qui est une lignée cellulaire immortalisée spontanément isolée d&#39;un patient de 36 ans avec des changements fibrokystique, ont été utilisés avec succès pour retrouver le phénotype bénigne du sein en 3D et 3,8 ont servi un système modèle pour étudier la fonction de suppresseur de tumeur oncogène et de plusieurs molécules 8,9. Ces cellules bénignes peuvent être conçues pour manipuler gène (s) d&#39;intérêt par la mise en place de lentivirus / rétrovirus. Si le gène (s) d&#39;intérêt est un gène suppresseur de tumeur, shRNA knockdown médié va conduire à une transformation maligne alors que si le gène d&#39;intérêt est une surexpression de l&#39;oncogène dans des cellules bénignesdevrait montrer un phénotype malin. Dans les deux cas, les structures acineuses formées en 3D peuvent capturer la transformation maligne. Cellules individuelles bénignes plaqués en 3D commencent à proliférer et former autour des structures sphériques. 5-8 jours par cet agrégat sphérique de cellules se différencier en une couche entourant polarisée de cellules qui est en contact avec le Matrigel, et une masse interne de cellules polarisées moins, qui manquent de contact avec le Matrigel. Dans les 10-15 prochains jours les cellules internes vont commencer à mourir par apoptose formant une lumière claire. Les cellules malignes se développeront perdre au hasard de leur polarité. Cellules hautement malignes forment habituellement structures de branchement. Ces différences dans le phénotype peuvent être capturés par temps imagerie en contraste de phase de déchéance et in situ par immunomarquage avec des marqueurs moléculaires pertinents. Les marqueurs les plus couramment utilisés sont les alpha 6-intégrine, un marqueur de la polarité de la base, en combinaison avec le marqueur de prolifération phospho-histone 3 et la apoptotmarqueur ic caspase-3. Ce dernier point est important de déterminer si il ya formation lumen dans le centre de la acini, une caractéristique des cellules normales et bénignes du sein. D&#39;autres marqueurs de polarité et de contact cellule-cellule comprennent GM130, la laminine, ERM, la E-cadhérine. Alternativement les lignées cellulaires de cancer du sein peuvent être conçues pour manipuler le gène d&#39;intérêt. Dans ce cas, le retour à un phénotype plus bénin arrêté la croissance peut être utilisé comme une lecture à distinguer du phénotype du cancer. Culture 3D peut également être utilisée avec précaution pour délimiter les voies de signalisation impliquées dans la transformation maligne de 10 à 11. Utilisation de l&#39;mentionnés ci-dessus se lit en inhibiteurs pharmacologiques, des anticorps bloquants ou des protéines recombinantes peut être utilisé être identifier à la signalisation moléculaire conduisant à la transformation maligne. Avec la poursuite des efforts de différents laboratoires, il est possible d&#39;extraire les cellules de la 3D à isoler l&#39;ARN et également préparer des lysats pour immuno et immuniténoprecipitation. Ces stratégies sont décrites dans un pas à pas et de manière détaillée dans le protocole.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced matrigel</td>
			<td style="width:83px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:167px;">Avoid repeat freeze thaw&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass hamber slides 8-well</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177402</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass chamber slides 2- well&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177380</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">goat anti mouse F(ab&#180;)2 fragment</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent conjugated Alexa antibodies</td>
			<td style="width:83px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Please look at molecular probes website</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:83px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">3D Culture Cell Harvesting kit</td>
			<td style="width:83px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">3448-020-k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Apha-6-integrin</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MAB1378</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-GM130</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610822</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">16-222</td>
			<td>1:100 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td>
			<td style="width:83px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">9661s</td>
			<td>1:50 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-E-cadherin</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610181</td>
			<td>1:200 dilution for IF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells

Les carcinomes du sein invasifs sont un groupe de tumeurs épithéliales malignes caractérisé par l&#39;invasion des tissus adjacents et la propension à former des métastases. L&#39;interaction des signaux entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement exerce une forte influence sur la croissance du cancer du sein et le comportement biologique 1. Cependant, la plupart de ces signaux de la matrice extracellulaire sont perdus ou leur pertinence est sous-lorsque les cellules sont cultivées dans deux cultures dimensions (2D) en monocouche. Au cours des dernières années, en trois dimensions (3D) de la culture sur une membrane basale reconstituée a émergé comme une méthode de choix pour récapituler l&#39;architecture tissulaire de cellules bénignes et malignes du sein. Les cellules cultivées en 3D conservent les signaux importants de la matrice extracellulaire et fournissent un système ex vivo 2,3 physiologiquement pertinent. Fait à noter, il existe des preuves de plus en plus ce qui suggère que les cellules se comportent différemment lorsqu&#39;ils sont cultivés en 3D par rapport à la 2D 4. Culture 3Dpeut être efficacement utilisé comme un moyen pour différencier le phénotype malin du phénotype bénigne du sein et de la signalisation cellulaire qui sous-tend moléculaire impliqué et 3. L&#39;une des caractéristiques distinctives des cellules épithéliales bénignes, c&#39;est qu&#39;ils sont polarisés de telle sorte que le cytoplasme apical est vers le lumen et le cytoplasme basal repose sur la membrane basale. Cette polarité apico-basale est perdue dans les carcinomes du sein invasifs, qui sont caractérisées par une désorganisation cellulaire et la formation de l&#39;anastomose et de ramification tubules qui s&#39;infiltre au hasard le stroma environnant. Ces différences histopathologiques entre glande bénigne et le carcinome invasif peuvent être reproduits en 3D 6,7. Utilisation des lecture-out appropriées comme la quantification de simples structures acineuses rondes, ou l&#39;expression différentielle des marqueurs moléculaires validées pour la prolifération cellulaire, la polarité et l&#39;apoptose en combinaison avec d&#39;autres techniques de biologie moléculaire et cellulaire, cultur 3De peut fournir un outil important pour mieux comprendre les changements cellulaires au cours de la transformation maligne et de la délimitation de la signalisation responsable.

Culture 3D peut être efficacement utilisé pour différencier le phénotype malin des cellules épithéliales mammaires humaines du sein bénigne. Cellules bénignes simples plaqués sur Matrigel poussent comme des structures sphériques organisés qui peuvent facilement être imagés comme unique acini plat rond dans un plan en utilisant l&#39;imagerie de contraste de phase. Les cellules malignes simples plaqués sur Matrigel poussent au hasard, montrent très haut indice de réfraction et sont difficiles à l&#39;ima...

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Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Trois culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée est un procédé utile de rappeler l&#39;architecture in vivo du sein bénigne, et pour différencier le phénotype malin du phénotype bénignes du sein. Surtout, ce système peut être appliqué pour étudier les carcinomes invasifs dans d&#39;autres tissus.

Trois Cultures dimensionnelles: un outil pour étudier l&#39;architecture normale Acinaire vs transformation maligne des cellules mammaires

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