Name: three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells
Uploaded: 2014-04-25T14:45:00
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この作品は、NIHの助成金R01 CA107469、R01 CA125577、およびCGのKleer、ミシガン州のがんセンターのサポート大学がU01CA154224によってサポートされていました。

1。材料の作製と培養培地<ol><li> 4℃のCO / Nの減少融解成長因子（GFR）マトリゲル</li><li> 37℃での必要な細胞株について完全なメディアを温めるMCF10A-ATCCは、メディアを指定していました。 5％ウシ胎児血清を補充したHME-HamのF-12培地、1μg/ mlのヒドロコルチゾン、5μg/ mlのインスリン、10 ng / mlの上皮増殖因子、および100 ng / mlのコレラ毒素; 5％FBS、2μg/ mlのヒドロコルチゾン及び5μg/ mlのインス...

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	<li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+in+breast+development+and+disease.">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li><li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors.">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).</li><li>Rosen, P. P., Rosen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosen's breast pathology. , (2008).</li><li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay.">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li><li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1/p38+pathway,+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer.">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li><li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-&#946;+receptor.">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-&#946; receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts.">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth,+progression,+and+metastasis+to+bone.">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li><li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells.">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li><li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes.">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li></ol>

ここでは、再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養および悪性対良性乳房表現型を区別するために、このシステムの有用性を記載している。このシステムはまた、他の腺組織由来の培養物の異なる細胞型に使用することができ、いくつかの正常12-14に名前を付けるために、培養前立腺上皮、気管支上皮、および甲状腺上皮細胞に使用されてきたことが報告されている。 3D?...

再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養（3D）は、複雑な表現型および正常乳房および乳癌2,3の関連するシグナリングを研究するための重要なモデル系である。乳房の機能ユニットは、腺房へ分岐する小さなダクトで構成され、端末のダクト小葉単位（TDLU）です。腺房は、基底膜によって囲まれている5つの細胞層、上皮細胞および筋上皮細胞からなる高度に組織化された構造である。正常な腺房の最も顕著な特徴は、細胞の分極、基盤となる基底膜への付着や、特殊な細胞間接触である。この複雑な組織は浸潤癌で破壊されている。細胞が単層として成長させた広く使用されている2次元培養は、腺房の形成を可能にしないでください。このように、単層培養上皮細胞との間の複雑な関係を捕捉するシステムを提供することに欠けている正常な乳房と乳がんでの規制緩和にある。乳房細胞の機能的単型上皮培養物をいくつかの研究室2,3に開発されている。三次元培養は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞由来の可溶化抽出物であり、市販されてマトリゲル上の乳房細胞の増殖を伴う。コラーゲンのような他の3D基層はIもまた使用される。乳癌細胞は、細胞がマトリゲル2で培養埋め込 ​​まれている3D埋め込 ​​みアッセイにより3次元で培養することができる。あるいは、細胞はまた、マトリゲルより少ない量を必要とし、位相コントラスト撮影によってコロニー形成の時間経過のモニタリングを容易にし、 その場イメージング 2 のために理想的であるように費用対効果のある、3Dオーバーレイアッセイ、いわゆる、トップアッセイに3Dで培養することができる-3。上部アッセイに3Dは腺房表現型および遺伝子発現プロファイル7との間の相関を定義するために使用されている。 3D文化がeffectivすることができますエリー浸潤癌から正常および良性の細胞を区別するために使用される。通常の良性乳腺細胞が浸潤癌細胞が内腔の無いクリアで多産し、無計画に成長する一方で成長がマトリゲル上の中心部にある、明確に定義されたルーメンと偏光構造を逮捕形成している。 E6/E7不死化ヒト乳腺上皮細胞および線維嚢胞性変化を有する36歳の患者から単離された自然発生的に不死化細胞株であるMCF10A細胞株は、正常な3D 3,8における良性乳房表現型を再捕捉するために使用されているとして役立ったいくつかの分子8,9の発癌と腫瘍抑制機能を研究するためのモデルシステム。これらの良性の細胞は、レンチウイルス/レトロウイルスを導入することによって、目的の遺伝子（単数または複数）を操作するために操作することができる。目的の遺伝子（群）は、腫瘍抑制因子である場合は、目的の遺伝子が良性細胞では癌遺伝子の過剰発現であるかのに対し、shRNAを媒介ノックダウンは、悪性形質転換につながる悪性の表現型を示すべきである。どちらの場合も、3Dで形成された腺房構造は、悪性形質転換をキャプチャすることができます。 3Dでメッキ良性単一細胞は増殖し、球状構造ラウンドフォルムを開始します。一日5-8による細胞のこの球状凝集体は、マトリゲルと接触している細胞の周囲の偏光層と、マトリゲルとの接触を欠く少ない極性細胞の内塊へと分化する。次の10〜15日に、内側の細胞はアポトーシスが明らかに管腔を形成することにより、死に始めます。悪性細胞は、それらの極性を失って無計画に成長します。悪性度の高い細胞は、通常、分岐構造を形成する。表現型におけるこれらの差異は、タイムラプス位相コントラスト撮影によりその場で関連する分子マーカーを用いた免疫染色によって捕捉することができる。最も一般的に使用されるマーカーは、増殖マーカーホスホ - ヒストン3およびapoptotと組み合わせて、α-6インテグリン、基底極性マーカーであるでICマーカーはカスパーゼ-3を切断した。後者は、腺房の中心、正常および良性の乳房細胞の機能における内腔の形成があるかどうかを決定することが重要である。他方の極性と細胞間接触マーカーはGM130、ラミニン、ERM、E-カドヘリンが含まれる。交互に乳癌細胞株は、目的の遺伝子を操作するために操作することができる。この場合、それ以上の成長への復帰は、良性の表現型は癌表現型と区別するために読むようにして使用することができ逮捕した。 三次元培養はまた、悪性形質転換注意深く10-11に関与するシグナル伝達経路を描写するために使用することができる。使用して、上記リードアウト、薬理学的阻害剤、遮断抗体又は組換えタンパク質を挙げるが悪性形質転換をもたらすシグナル伝達分子で突き止めることに使用することができる。種々の研究室からの継続的な努力とそれがRNAを単離し、また、免疫ブロット法および免疫のための溶解物を調製するために3Dから細胞を抽出することが可能であるnoprecipitation。これらの戦略は、プロトコルの段階的かつ詳細に説明されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced matrigel</td>
			<td style="width:83px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:167px;">Avoid repeat freeze thaw&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass hamber slides 8-well</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177402</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass chamber slides 2- well&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177380</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">goat anti mouse F(ab&#180;)2 fragment</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent conjugated Alexa antibodies</td>
			<td style="width:83px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Please look at molecular probes website</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:83px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">3D Culture Cell Harvesting kit</td>
			<td style="width:83px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">3448-020-k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Apha-6-integrin</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MAB1378</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-GM130</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610822</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">16-222</td>
			<td>1:100 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td>
			<td style="width:83px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">9661s</td>
			<td>1:50 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-E-cadherin</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610181</td>
			<td>1:200 dilution for IF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells

浸潤性乳癌の転移に隣接する組織や性向の侵入を特徴とする悪性上皮性腫瘍の一群である。癌細胞とそれらの微小環境との間の信号の相互作用は、乳癌の成長および生物学的挙動1に強力な影響を与える。しかし、細胞外マトリックスからのこれらの信号の大部分が失われたり、細胞を単層として2次元培養（2D）で栽培されている場合、その関連性が代役されています。近年では、再構成基底膜上の3次元（3D）培養物は、良性および悪性の乳房細胞の組織構造を再現するための選択の方法として浮上している。 3Dで増殖した細胞は、細胞外マトリックスからの重要な手がかりを保持し、生理学的に関連するex vivoでのシステム2,3を提供する。注目すべきは、2次元4と比較して、3Dで増殖させたときの細胞は異なる挙動を示すことを示唆している証拠が増えている。三次元培養効果的に3関与良性乳房表現型から悪性表現型を区別するための手段として、および細胞および分子のシグナル伝達を支えるために使用することができる。良性の上皮細胞の顕著な特徴の1つは、頂端細胞質内腔に向かってであり、基底細胞質は基底膜上に載るように、それらが偏光されることである。このapico - 基底極性がでたらめに周囲の間質に浸透細管を吻合及び分岐の細胞崩壊と形成を特徴としている浸潤性乳癌で失われます。良性腺と浸潤癌との間に、これらの病理組織学的な違いは、3D 6,7で再生することができる。単一ラウンド腺房構造の定量のような適切なリードアウトを用いて、又は他の分子および細胞生物学技術と組み合わせて、細胞増殖、およびアポトーシスの極性が検証分子マーカーの発現を差動に、3D culturEは、より良い悪性形質転換の際に、責任あるシグナリングの輪郭を描くための細胞の変化を理解するための重要なツールを提供することができます。

3D培養物を効果的に良性の乳房からのヒト乳房上皮細胞の悪性の表現型を区別するために使用することができる。マトリゲル上にプレートし、単一の良性細胞が簡単に位相コントラストイメージングを用いて1つの平面内でラウンドフラット腺房として画像化することができる組織化球状構造として成長。マトリゲル上に播種単一の悪性細胞が、偶然に成長する非常に高い屈折率を示し、一平...

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Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

再構成基底膜上の乳房上皮細胞の三次元培養は、良性乳房のインビボアーキテクチャを再現するために、良性乳房表現型から悪性の表現型を区別するために有用な方法である。重要なことに、このシステムは、他の組織に浸潤癌を研究するために適用することができる。

三次元文化：乳細胞の悪性形質転換正常対腺房アーキテクチャを研究するためのツール

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

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アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

ヒト下垂体腺腫細胞の三次元アルギン酸ビーズ文化

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

正常および病的脳機能を研究するために脳深部刺激でSaccadometryを使用します

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...