Name: three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells
Uploaded: 2014-04-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH гранты R01 CA107469, R01 CA125577 и U01CA154224 к CG Kleer, Университета онкологический центр поддержки Мичигана.

1. Подготовка материалов и культура СМИ <ol><li> Оттепель фактор роста снижается (СКФ) Матригель при 4 ° СО / Н. </li><li> Разминка полные носители для требуемой клеточной линии при 37 ° С MCF10A-АТСС указано СМИ; F-12 средний HME-Хэма с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, 1 мкг / мл гидрокортизона, 5 ?...

<ol>
	<li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+in+breast+development+and+disease.">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li><li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors.">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).</li><li>Rosen, P. P., Rosen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosen's breast pathology. , (2008).</li><li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay.">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li><li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1/p38+pathway,+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer.">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li><li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-&#946;+receptor.">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-&#946; receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts.">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth,+progression,+and+metastasis+to+bone.">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li><li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells.">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li><li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes.">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li></ol>

Мы описали здесь трехмерную культуру эпителиальных клеток молочной железы на восстановленного базальной мембраны и полезность этой системы различать фенотипа доброкачественной молочной злокачественная против. Эта система также может быть использован для культуры различных типов ?...

Трехмерная культура (3D) молочной эпителиальных клеток на восстановленного базальной мембраны является важным модельной системой для изучения сложного фенотипа и связанного сигнализацию нормальной молочной железы и рака молочной железы 2,3. Функциональная единица груди является выводной проток очаговая блок (TDLU), который состоит из небольшой канал, который разветвляется на ацинусов. В ацинусы очень организованные структуры, состоящие из двух слоев клеток, эпителиальных и миоэпителиальных клеток, которые окружены базальной мембраной 5. Наиболее отличительные черты нормальных ацинусов являются клеточными поляризация, привязанность к подлежащей базальной мембраны и специализированные контакты межклеточные. Это сложная организация нарушается в инвазивным раком. Широко используемые 2D культур, где клетки выращивают в виде монослоев, не позволяют для формирования ацинусов. Таким образом, монослой культуры недостает обеспечение системы для захвата сложную взаимосвязь между эпителиальными клеткамив нормальном груди и их дерегулирования при раке молочной железы. Функциональные монотипический эпителиальные культуры клеток молочной железы были разработаны в нескольких лабораториях 2,3. 3D культура включает рост клеток молочной железы на Матригель, который является солюбилизированного экстракта получают из Engelbreth-Холм-Swarm клеток саркомы мыши и коммерчески доступен. Другие 3D субстраты, как коллаген Я также используются. Груди клетки можно культивировать в 3D на 3D встроенного анализа, где культивируют клетки встроены в Матригель 2. Кроме того, клетки можно культивировать на 3D на верхнем анализа, которая также называется 3D наложения Пробирной, который является экономически эффективным, так как требует меньшего объема Матригель, и облегчает времени мониторинг прошествии образования колоний контрастной томографии фазы и идеально подходит для на месте визуализации 2 -3. 3D сверху анализа был использован для определения корреляции между ацинозной фенотипа и профиля экспрессии генов 7. 3D культура может быть effectivелы используется, чтобы различать нормальные и доброкачественных клеток от инвазивной карциномы. Нормальные и доброкачественные клетки груди образуют рост арестован поляризованных структур с четко определенными просвет в центре на Матригель тогда инвазивные клетки карциномы растут в изобилии и бессистемно, без очистки просвета. Е6/Е7 увековечены человека эпителиальные клетки молочной железы и клеточной линии MCF10A, который является спонтанно увековечены клеточная линия, выделенный из 36-летнего пациента с фиброзно-кистозной изменений, были успешно использованы, чтобы вернуть фенотип доброкачественной молочной железы в 3D 3,8 и послужили модельная система для изучения онкогенных и супрессоров опухолей функцию нескольких молекул 8,9. Эти доброкачественные клетки могут быть спроектированы, чтобы манипулировать ген (ы) из интереса путем введения лентивирусов / ретровируса. Если ген (ы) интерес представляет собой супрессор опухоли, shRNA обусловленный нокдаун приведет к злокачественной трансформации, тогда как, если интересующий ген является избыточная экспрессия онкогена в клетки доброкачественныхдолжен показать злокачественного фенотипа. В обоих случаях ацинарные структуры, образованные в 3D может захватить злокачественной трансформации. Доброкачественные одиночные клетки высевали в 3D начинают размножаться и образуют вокруг сферические структуры. Днем 5-8 этот сферический агрегат клеток будет дифференцироваться в окружающей поляризованного слоя клеток, который находится в контакте с Матригель и внутренней массой менее поляризованных клетках, в которых отсутствует контакт с Матригель. В ближайшие 10-15 дней внутренние клетки начинают умирать от апоптоза формирования четкого просвет. Злокачественные клетки будут расти случайно теряют свою полярность. Высоко злокачественные клетки обычно образуют ветвящиеся структуры. Эти различия в фенотипа могут быть захвачены времени контрастности изображений промежуток фазы и на месте иммуноокрашивания с соответствующими молекулярных маркеров. Наиболее часто используемые маркеры альфа 6-интегрин, базальный полярность маркер, в сочетании с распространением маркера фосфо-гистон 3 и apoptotМикросхема маркер расщепляется каспазы-3. Последнее важно, чтобы определить, есть ли просвет формирование в центре ацинусов, особенность нормальных и злокачественных клеток молочной железы. Другие полярности и межклеточного контакта маркеры включают GM130, ламинин, ERM, E-кадгерина. В качестве альтернативы линии клеток рака молочной железы может быть спроектирован для управления представляющий интерес ген. В этом случае возврат к более роста доброкачественных задержанного фенотип может быть использован как считывать отличить от фенотипа рака. 3D культура также может использовать осторожно, чтобы очертить сигнальные пути, участвующие в злокачественной трансформации 10-11. Использование указанное выше индикаторы, устройства фармакологические ингибиторы, блокирующие антитела или рекомбинантные белки могут быть использованы быть точно на молекулярном сигнализации, ведущие к злокачественной трансформации. С неустанные усилия различных лабораториях можно извлечь клетки от 3D изолировать РНК, а также подготовить лизатов для иммуноблотинга и IMMUnoprecipitation. Эти стратегии описаны в поэтапной и подробным образом в протоколе.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced matrigel</td>
			<td style="width:83px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:167px;">Avoid repeat freeze thaw&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass hamber slides 8-well</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177402</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass chamber slides 2- well&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177380</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">goat anti mouse F(ab&#180;)2 fragment</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent conjugated Alexa antibodies</td>
			<td style="width:83px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Please look at molecular probes website</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:83px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">3D Culture Cell Harvesting kit</td>
			<td style="width:83px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">3448-020-k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Apha-6-integrin</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MAB1378</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-GM130</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610822</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">16-222</td>
			<td>1:100 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td>
			<td style="width:83px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">9661s</td>
			<td>1:50 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-E-cadherin</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610181</td>
			<td>1:200 dilution for IF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells

Инвазивным раком молочной железы представляют собой группу злокачественных эпителиальных опухолей характеризуется вторжения в соседние ткани и склонность к метастазированию. Взаимодействие сигналов между раковыми клетками и их микросреды оказывает мощное влияние на рост рака молочной железы и биологическое поведение 1. Тем не менее, большинство из этих сигналов от внеклеточного матрикса, потеряны или их актуальность недостаточно изучена, когда клетки выращивают в культуре двумерной (2D) в виде монослоя. В последние годы трехмерная (3D) культура на восстановленного базальной мембраны возник как метод выбора резюмировать тканевое архитектуру доброкачественных и злокачественных клеток молочной железы. Клетки, выращенные в 3D сохранить важные сигналы от внеклеточного матрикса и обеспечить физиологически соответствующую Экс Vivo системы 2,3. Следует отметить, что появляется все больше доказательств предполагая, что клетки ведут себя по-разному при выращивании в 3D по сравнению с 2D 4. 3D культурамогут быть эффективно использованы в качестве средства различения злокачественного фенотипа с фенотипом доброкачественной молочной и лежащие в основе клеточных и молекулярных сигналов участвуют 3. Одной из отличительных характеристик доброкачественных эпителиальных клеток является то, что они поляризованы так, чтобы верхушечная цитоплазма к полости, а базальная цитоплазма лежит на базальной мембране. Это апикально-базальной полярности теряется в инвазивным раком молочной железы, которые характеризуются клеточной дезорганизации и формирования анастомоз и ветвление канальцы, что случайно проникает в окружающий стромы. Эти гистологические различия между доброкачественной железы и инвазивным раком могут быть воспроизведены в 3D 6,7. Используя соответствующие выходы для чтения как количественного один раунд ацинарных структур или дифференциальной экспрессии проверенных молекулярных маркеров для клеточной пролиферации, полярности и апоптоза в сочетании с другими молекулярных и клеточных методов биологии, 3D культурное может служить важным инструментом для лучшего понимания клеточных изменений во злокачественной трансформации и для очерчивания ответственного сигнализации.

3D культура может быть эффективно использован для дифференциации злокачественной фенотип эпителиальных клеток молочной железы человека от доброкачественной груди. Одиночные доброкачественные клетки высевали на Матригель расти как организованных сферических структур, которые могу?...

Watch this Scientific Journal Video about Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells at JoVE.com

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Трехмерная культура эпителиальных клеток молочной железы на восстановленного базальной мембраны является полезным методом резюмировать архитектуру в естественных условиях доброкачественной груди, и дифференцировать злокачественные фенотипа от фенотипа доброкачественной молочной железы. Важно отметить, что эта система может быть применена для изучения инвазивных карцином в других тканях.

Трехмерные культуры: инструмента для изучения Normal Acinar Архитектура против злокачественной трансформации клеток молочной железы

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Человека нейроэндокринной опухоли клеточных линий в качестве трехмерных моделей по изучению прав нейроэндокринные опухоли терапия

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Трехмерная Tissue Culture моделью для изучения первичного костного мозга человека и его злокачественных новообразований

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Количественное определение клеток рака молочной железы инвазивности Использование трехмерной (3D) модель

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Ортотопическая инъекции клеток рака молочной железы в молочной жировой ткани мышей для изучения роста опухоли.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Модель для изучения действия гормонов в груди человека

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Использование аденоассоциированные Касперского как инструмент для изучения сетчатки барьеров при болезни

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Трехмерная (3D) опухоли Сфероид Вторжение Пробирной

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Трехмерная альгинат-шарик культуре человеческих клеток аденомы гипофиза

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

Использование Saccadometry с Глубокая стимуляция мозга для изучения нормальной и патологической функции мозга

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...