Name: a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells
Uploaded: 2014-04-11T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells at JoVE.com

ونحن ممتنون للدكتور ستيفن روبنسون والسيدة هانية Czerwinska (جامعة موناش) لتوريد سخية من الثقافات نجمية.

1. تحديد أسكوربات بين الخلايا في الخلايا المستزرعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة الخلايا والحصاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو التعليق (مثل ابيضاض الدم الاحمراري الإنسان، K562) أو الخلايا الملتصقة (مثل</...

<ol>
	<li>Buettner, G. R., Schafer, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albert+Szent-Gy&#246;rgyi:+vitamin+C+identification.">Albert Szent-Gy&#246;rgyi: vitamin C identification.</a> Biochem. J. , (2006).</li><li>Padayatty, S. J., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+physiology+and+pharmacology+of+vitamin.">New insights into the physiology and pharmacology of vitamin.</a> C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).</li><li>Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+dependence+of+the+hypoxia-inducible+factor+hydroxylases+(factor+inhibiting+HIF+and+prolyl+hydroxylase+domain+2)+on+ascorbate+and+other+reducing+agents.">Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents.</a> Biochem. J. 427, 135-142 (2010).</li><li>Manning, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+Promotes+Maturation+of+T-Cells.">Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).</li><li>Asard, H., et al., Banerjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Redox Biochemistry. , 22-37 (2007).</li><li>Aguirre, R., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+vascular+bed:+Importance+of+vitamin.">Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin.</a> C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).</li><li>May, J. M., Qu, Z. -. c., Mendiratta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+and+recycling+of+a-tocopherol+in+human+erythrocytes+by+intracellular+ascorbic+acid.">Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid.</a> Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).</li><li>Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+some+major+functions+of+vitamin+C+in+animals.">Synthesis and some major functions of vitamin C in animals.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).</li><li>Rumsey, S. C., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+transport+and+disposition+of+ascorbic+acid+in+humans.">Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans.</a> J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).</li><li>Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+chromosomal+mapping+of+the+human+nonfunctional+gene+for+L-gulono-g-lactone+oxidase,+the+enzyme+for+L-ascorbic+acid+biosynthesis+missing+in+man.">Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man.</a> J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).</li><li>Challem, J. J., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses,+ascorbate,+mutations,+in+the+evolution+of+Homo+sapiens.">Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens.</a> Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).</li><li>Nishikimi, M., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+the+deficiency+in+humans+of+gulonolactone+oxidase,+a+key+enzyme+for+ascorbic+acid+biosynthesis.">Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis.</a> Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).</li><li>Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. i. t. a. m. i. n. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=recycling+and+degradation+in+mammals.">recycling and degradation in mammals.</a> FEBS J. 274, 1-22 (2007).</li><li>May, J. M., Qu, Z. -. c., Qiao, H., Koury, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+loss+of+the+vitamin+C+transporter+in+erythrocytes.">Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).</li><li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vitamin+C+transport.">Regulation of vitamin C transport.</a> Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).</li><li>Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pecking+order+of+free+radicals+and+antioxidants:+lipid+peroxidation,+a-tocopherol,+and+ascorbate.">The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).</li><li>May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+ascorbic+acid+an+antioxidant+for+the+plasma+membrane.">Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane.</a> FASEB J. 13, 995-1006 (1999).</li><li>Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+-+important+for+iron+metabolism.">Ascorbic acid - important for iron metabolism.</a> Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transferrin+iron+reduction+and+uptake+are+regulated+by+transmembrane+ascorbate+cycling+in+K562+cells).">Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells).</a> J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+routes+of+iron+accumulation+in+astrocytes:+ascorbate-dependent+ferrous+iron+uptake+via+the+divalent+metal+transporter+(DMT1)+plus+an+independent+route+for+ferric+iron.">Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron.</a> Biochem. J. 432, 123-132 (2010).</li><li>Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+iron+uptake+is+stimulated+by+ascorbate+via+an+intracellular+reductive+mechanism.">Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).</li><li>Lawen, A., Lane, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+iron+homeostasis+in+health+and+disease:+uptake,+storage,+transport,+and+molecular+mechanisms+of+action.">Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action.</a> Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+in+the+brain.">Ascorbic acid in the brain.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).</li><li>Harrison, F. E., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+function+in+the+brain:+vital+role+of+the+ascorbate+transporter+SVCT2.">Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2.</a> Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).</li><li>Rebec, G. V., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vitamin+as+neuromodulator:+ascorbate+release+into+the+extracellular+fluid+of+the+brain+regulates+dopaminergic+and+glutamatergic+transmission.">A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission.</a> Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).</li><li>Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+view+at+C.">New view at C.</a> Nat. Med. 8, 445-446 (2002).</li><li>Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid:+Chemistry,+biology+and+the+treatment+of+cancer.">Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).</li><li>Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+stimulates+ascorbate+transport+by+astrocytes.">Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes.</a> Brain Res. 858, 61-66 (2000).</li><li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+uptake.">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li><li>May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -. c. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+transport+and+recycling+by+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells:+response+to+glutamate+toxicity.">Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity.</a> Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+regulation+and+its+neuroprotective+role+in+the+brain.">Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain.</a> Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutamate+aspartate+transporter+(GLAST)+mediates+L-glutamate-stimulated+ascorbate-release+via+swelling-activated+anion+channels+in+cultured+neonatal+rodent+astrocytes.">The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes.</a> Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+and+plasma+membrane+electron+transport+-+enzymes+vs+efflux.">Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).</li><li>Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume-sensitive+organic+osmolyte/anion+channels+in+cancer:+novel+approaches+to+studying+channel+modulation+employing+proteomics+technologies.">Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).</li><li>Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+methods+for+simultaneous+determination+of+ascorbic+and+dehydroascorbic+acids.">HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids.</a> Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).</li><li>Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+assay+for+ascorbate+using+a+plate+reader.">A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader.</a> Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+colorimetric+microplate+ferrocyanide+assay+applied+to+ascorbate-stimulated+transplasma+membrane+ferricyanide+reduction+and+mitochondrial+succinate+oxidation.">A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation.</a> Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Na+/H++exchangers+and+intracellular+pH+in+regulating+vitamin+C-driven+electron+transport+across+the+plasma+membrane.">A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane.</a> Biochem. J. 428, 191-200 (2010).</li><li>Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+for+transport+and+efflux+of+ascorbate+and+dehydroascorbate.">Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).</li><li>Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances.">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li><li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay.">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors.">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li><li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes.">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li><li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol.">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li><li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide.">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li></ol>

في هذه الورقة نقدم اثنين السريع ومحددة وحساسة نسبيا المقايسات صفيحة ميكروسكوبية اللونية لتحديد أسكوربات المستمدة من المقصورات داخل وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة. المقايسات يمكن أن تكتمل مع إمكانية الوصول إلى المعدات المختبرية القياسية والكواشف. كاشف فقط تكلف?...

كان اكتشاف الطبيعة الكيميائية للحمض الاسكوربيك (فيتامين C)، وتحديد على أنه &quot;عامل مكافحة حفري&quot; يسعى منذ فترة طويلة، من قبل ألبرت زينت-جيورجي وغيرهم في الأبحاث المنشورة 1928-1934 1 الأحداث البارزة في التاريخ الكيمياء الحيوية. في الواقع، ساهمت هذه الاكتشافات إلى زينت جيورجي-حصوله على جائزة نوبل في الفسيولوجيا أو الطب عام 1937. جناح الآخذة في التوسع من أدوار لأسكوربات في علم وظائف الأعضاء الحيوانية والنباتية، وكذلك صحة الإنسان، لا تزال نشطة من الموضوعات العلمية التحقيق والجدل. L-أسكوربات هو اختزال الفسيولوجية وفيرة وانزيم العامل المساعد في نظم الثدييات، وتساهم في العديد من التفاعلات الإنزيمية محددة جيدا تنطوي على الهيدروكسيل والكولاجين، والكارنيتين بافراز الحيوي، والتمثيل الغذائي التيروزين وهرمون الببتيد amidation 2. يثير الاهتمام والفضول، evide تصاعديوحي بأن الامتحانات التنافسية الوطنية أسكوربات يلعب دورا في تحفيز dioxygenases التي تعتمد على الحديد الأخرى، مثل prolyl وasparaginyl hydroxylases المشاركة في الهيدروكسيل واستهداف عوامل محرض نقص الأكسجة (HIFs) 1α و2α 3. يقترح تقرير حديث أن أسكوربات يلعب دورا في نضوج الخلايا التائية من خلال لونين تؤثر نزع الميثيل عبر نشاطها في تحفيز hydroxylases النووية، Jumonji C (JmjC) البروتينات المجال؛ وهذه الأخيرة التي يبدو أنها تتطلب أسكوربات عن النشاط الكامل 4. في الواقع، يبدو أن التحفيز هذه الانزيمات التي كتبها أسكوربات أن يحدث من خلال آلية مماثلة إلى التحفيز من قبل أسكوربات من مؤسسة الحرمين والكولاجين hydroxylases. من بين الآثار الكلاسيكية الأخرى، أسكوربات يساهم بشكل كبير في مضادة الأكسدة الخلوية وكسر سلسلة زبال الراديكالية للذوبان في الماء (5) وإلى إعادة تدوير غشاء البلازما α توكوفيرول (فيتامين E) عن طريق الحد من α-tocopheroxyl جذرية 6، ثhich المهم في حماية الغشاء ضد بيروكسيد الدهون 7. الأهم من ذلك، على الرغم من أن معظم الثدييات قادرة على دي نوفو توليف كبدي من أسكوربات من مد الجلوكوز، القرود العليا، خنازير غينيا وبعض الخفافيش تعتمد على المصادر الغذائية من فيتامين 8. وهذا يرجع إلى تثبيط الجين GULO، وorthologues منها في الثدييات تتأثر ترميز الانزيم، γ-gulono-اكتون أوكسيديز 9-13. مطلوب هذا الانزيم للتفاعل النهائي في أسكوربات الحيوي من الجلوكوز 13. بعد امتصاص بوساطة نقل من تجويف الأمعاء في البشر، ويتم توزيع أسكوربات في جميع أنحاء الجسم عن طريق الدورة الدموية. وعادة ما يتم العثور على الفيتامين في شكله انخفاض في تركيزات millimolar داخل الخلية (مع استثناء ملحوظ من الكريات الحمراء في تركيزات التي عادة ما تكون مماثلة لتركيز البلازما السائدة)، واضرب في مكروموليentrations (على سبيل المثال 50-200 ميكرومتر) في معظم سوائل خارج الخلية 14،15. في ظل الظروف الفسيولوجية، أسكوربات عادة تخضع لعملية الأكسدة عكسها إلكترون واحد إلى اسكوربيل الجذور الحرة (AFR؛ المعروف أيضا باسم monodehydroascorbate أو semidehydroascorbate). في حين أن AFR هو مستقر نسبيا الراديكالية 16، في غياب السريع إلكترون واحد للحد من الأنزيمية عودتها الى أسكوربات، يمكن أن اثنين AFRs تعزيز dismutate إلى أسكوربات واحد واحد dehydroascorbate (DHA) 9،13،17. في المناطق الداخلية من الخلية، وهما الإلكترون الأكسدة نتاج أسكوربات، DHA، ويمكن تخفيض بسرعة العودة إلى أسكوربات بواسطة الجلوتاثيون وNAD (P) الأنزيمية H-تعتمد وردود الفعل غير الأنزيمية 13. في حين أنه من المقبول أن كلاسيكي دورا هاما فقط أسكوربات في استقلاب الحديد هو تحفيز امتصاص الغذائية من الحديد غير الهيم 18، نحن وآخرون قدموا الأدلة قمما يشير إلى أن trongly إستعمال أسكوربات يلعب دورا توسع كبير في عملية التمثيل الغذائي لهذا المعدن. الأولى، أسكوربات التي يتم تحريرها من قبل خلايا أسكوربات تزخر يبدو أن تلعب دورا هاما في تحوير امتصاص الحديد غير ملزمة ترانسفيرين من قبل خلايا 19،20، والأدلة الأخيرة تشير إلى أن أسكوربات جدا أيضا ينظم امتصاص الحديد ملزمة ترانسفيرين من قبل خلايا 21، وهذه الأخيرة التي يناظر الفسيولوجية ممر رئيسي لامتصاص الحديد 22. أسكوربات أمر ضروري لوظيفة عادية في الجهاز العصبي المركزي الثدييات 23،24. جنبا إلى جنب مع القشرة الكظرية والغدة النخامية، الغدة الصعترية، الشبكية والجسم الأصفر، والدماغ يحتوي على تركيزات عالية من أسكوربات نسبة إلى أنسجة الجسم الأخرى 23،25-27. بالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف أن تعرض كل من الخلايا النجمية 28،29 والعصبية التي تشبه الخلايا خلايا 30 إلى الغلوتامات لتؤدي إلى الإفراج عن أسكوربات في الفضاء خارج الخلية، حيث ascorbatويعتقد الإلكترونية للمساعدة في حماية الخلايا العصبية التي يسببها ضد الغلوتامات العصبية العجز 31. في حين أن الآلية الدقيقة التي يسببها الغلوتامات الإفراج أسكوربات من الخلايا النجمية غير معروف، وقدمنا ​​مؤخرا أدلة تشير إلى تورط خلية التورم الناجم عن امتصاص الغلوتامات من الغلوتامات نجمية ونقل اسبارتاتي (GLAST؛ المعروف أيضا الأحماض الأمينية مثير نقل الإسوي 1 [EAAT1 ] في البشر) ويترتب على ذلك تفعيل osmolyte وأنيون قنوات الحساسة الحجم (VSOACs) التي هي قابلة للاختراق لالأنيونات العضوية الصغيرة مثل أسكوربات 32. تبقى الهويات الجزيئية للقنوات غشاء البلازما المشاركة في تشكيل VSOAC الكشف عن هويته 33،34. على الرغم من أن وضعت العديد من فحوصات لتحديد أسكوربات في العينات البيولوجية، والتي تشمل الطيف، وفلوروميتريك الكروماتوغرافي المقايسات 35،36، هناك الكثير من التباين في خصوصية وحساسية، interferencه من الملوثات الكيميائية، ومجموعة خطية فعالية واستقرار الحليلة نقطة النهاية. بالإضافة إلى ذلك، عوامل الأخرى التي تؤثر على اختيار الاختبار هي سرعة، وسهولة الاستخدام والوصول إلى المعدات المتخصصة نسبيا مثل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) الجهاز. نحن هنا تقديم مقايسة اللونية صفيحة ميكروسكوبية بسيطة ومحددة للغاية لتحديد أسكوربات الخلايا في الخلايا المستزرعة، فضلا عن فحص منفصل لتحديد أسكوربات-هروب رأس المال من الخلايا المستزرعة. يهدف الفحص الأخير للالتفاف على مشكلة التقليل من الإفراج أسكوربات من الخلايا نظرا لسرعة إعادة امتصاص أسكوربات صدر عن نقل أسكوربات التي تعتمد على الصوديوم (SVCTs). على الرغم من أن كل من هذه الأساليب التي ظهرت في بعض منشوراتنا السابقة 19،20،32،37،38، يوفر هذا المخطوط مجموعة واضحة من التعليمات والمبادئ التوجيهية للتنفيذ على نحو فعال.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Nunc 96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:135px;">Thermo</td>
			<td style="width:127px;">269620</td>
			<td style="width:132px;">Any flat-bottom 96-well plate can be used</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:284px;">Refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5415D</td>
			<td style="width:132px;">A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:74px;width:284px;">Refrigerated bench-top centrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5810R</td>
			<td style="width:132px;">Swing-bucket</td>
		</tr>
		<tr height="260">
			<td height="260" style="height:260px;width:284px;">Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer</td>
			<td style="width:135px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:284px;">Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">General-purpose buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:284px;">MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:284px;">HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2&#8226;2 H2O, 0.8 mM MgSO4&#8226;7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">General chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Highest purity preparations should be obtained</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30790</td>
			<td style="width:132px;">Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">C6762</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions prepared in DMSO or ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Ascorbate oxidase (AO)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A0157</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Potassium ferricyanide (FIC)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">455989</td>
			<td style="width:132px;">Trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&#8242;,5&#8242;&#8242;-disulfonic acid disodium salt)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">92940</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Sodium L-glutamate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Saponin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">47036</td>
			<td style="width:132px;">Prepare a 0.1% stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">3 M sodium acetate (pH 6.0)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.2 M citric acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">30 mM ferene-S</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stock solutions for ascorbate-efflux assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">AO (120 U/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">2.4 mM ferene-S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells

فيتامين C (أسكوربات) يلعب دورا هاما في العديد من الأيض الخلوي، وكثير منها قد تأتي فقط للضوء في السنوات الأخيرة. على سبيل المثال، داخل الدماغ، أسكوربات يتصرف بطريقة اعصاب وneuromodulatory التي تنطوي أسكوربات ركوب الدراجات بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية vicinal - وهي العلاقة التي يبدو أن تكون حاسمة لأسكوربات الدماغ التوازن. بالإضافة إلى ذلك، والأدلة الناشئة تشير بقوة إلى أن أسكوربات دورا توسع كبير في تنظيم استقلاب الحديد الخلوية والنظامية مما هو معترف بها تقليديا. الاعتراف المتزايد بدور لا يتجزأ من أسكوربات في الفيزيولوجيا الخلوية والعضوي الطبيعي وحررت تطالب مجموعة من المتوسطة الإنتاجية وذات حساسية عالية التقنيات التحليلية التي يمكن تنفيذها دون الحاجة إلى معدات متخصصة مكلفة للغاية. هنا نقدم تعليمات صريحة ل-الإنتاجية المتوسطة، فحص صفيحة ميكروسكوبية محددة وغير مكلفة نسبيا لتحديد بوال أسكوربات داخل وخارج الخلية في خلية ثقافة.

تحديد أسكوربات بين الخلايا في الخلايا المستزرعة تعليق في مقايسة الأولى (الشكل 1)، يتم تحديد أسكوربات داخل الخلايا، وبعد أسكوربات محددة (أي AO-الحساسة) الحد من فيري سيانيد لفيروسيانيد، وذلك باستخدام تقرير حساسة للغاية ...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells at JoVE.com

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

A السريع والنوعي صفيحة ميكروسكوبية الفحص لتحديد أسكوربات البينية وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة

أسكوربات يلعب العديد من الأدوار الهامة في عملية الأيض الخلوية، وكثير منها قد تأتي فقط للضوء في السنوات الأخيرة. نحن هنا وصف-الإنتاجية المتوسطة، فحص صفيحة ميكروسكوبية محددة وغير مكلفة لتحديد كلا أسكوربات داخل وخارج الخلية في خلية ثقافة.

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

العد وتحديد صلاحية خلايا مثقف

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

الكشف عن التعبير الجيني بين الخلايا في الخلايا الحية من الفئران، الإنسان ولحم الخنزير المنشأ عن طريق النانوية المسمى الإسفار

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

والسريعة، طريقة قابلة للعزل، دراسة وظيفية، وتحليل المصفوفة خارج الخلية المشتقة من خلية

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

التعبير عابرة والخلوية توطين البروتينات المؤتلف في الخلايا مثقف الحشرات

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

استخدام البروتينات النووية الذاتية من الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج بالانزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...