Name: a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells
Uploaded: 2014-04-11T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants au Dr Stephen Robinson et Mme Hania Czerwinska (Monash University) pour l&#39;offre généreuse de cultures d&#39;astrocytes.

1. Déterminer ascorbate intracellulaire dans les cellules cultivées <ol><li> culture cellulaire et la récolte <ol><li> Cultivez suspension (par exemple érythroleucémique humaine, K562) ou des cellules adhérentes (par exemple, les astrocytes primaires) en utilisant des procédures standard de culture 19-21,32,38. Remarque: pour assurer cellules contiennent ascorbate, charger les cellules en culture avec de l&#39;ascorbate soit comme l&#39;ascorbate ou DHA 33,39.<...

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	<li>Buettner, G. R., Schafer, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albert+Szent-Gy&#246;rgyi:+vitamin+C+identification.">Albert Szent-Gy&#246;rgyi: vitamin C identification.</a> Biochem. J. , (2006).</li><li>Padayatty, S. J., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+physiology+and+pharmacology+of+vitamin.">New insights into the physiology and pharmacology of vitamin.</a> C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).</li><li>Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. 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Dans ce document, nous présentons deux dosages colorimétriques des microplaques rapides, précis et relativement sensibles pour la détermination de l&#39;ascorbate dérivé de compartiments intra-et extracellulaires dans les cellules cultivées. Les analyses peuvent être complétées par l&#39;accès aux équipements et réactifs de laboratoire standard. Le réactif que modérément coûteux requis pour le dosage est AO, qui est essentielle, car elle donne un degré élevé de spécificité analyte vers <span class=...

La découverte de la nature chimique de l&#39;acide ascorbique (vitamine C), et son identification comme le «facteur anti-scorbutique&quot; longtemps cherché, par Albert Szent-Györgyi et d&#39;autres dans les documents publiés de 1928 à 1934 1 étaient événements marquants dans l&#39;histoire de la biochimie. En effet, ces découvertes ont contribué à Szent-Györgyi est attribué le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1937. L&#39;ensemble toujours croissant de rôles pour l&#39;ascorbate en physiologie animale et végétale, ainsi que la santé humaine, continuent à être les sujets de scientifique active enquête et de controverse. L-ascorbate est un réducteur physiologique abondante et cofacteur enzymatique dans des systèmes de mammifères, et contribue à de nombreuses réactions enzymatiques impliquant bien définies hydroxylation du collagène, de la carnitine et de la norépinéphrine la biosynthèse, le métabolisme de la tyrosine et de l&#39;hormone de peptide amidation 2. Curieusement, evide de montagence suggère que l&#39;ascorbate joue un rôle dans la stimulation d&#39;autres dioxygénases de fer-dépendants, tels que les hydroxylases prolyl et asparaginyle impliquées dans le ciblage et l&#39;hydroxylation des facteurs inductibles par l&#39;hypoxie (HIF) et 1α 2α 3. Un rapport récent suggère que l&#39;ascorbate joue un rôle dans la maturation des lymphocytes T en affectant la chromatine déméthylation via son activité en stimulant les hydroxylases nucléaires, Jumonji C (JmjC) protéines de domaine; ce dernier qui semble exiger ascorbate de pleine activité 4. En effet, la stimulation de ces enzymes par ascorbate semble se produire par un mécanisme similaire à la stimulation par l&#39;ascorbate de collagène et les HIF hydroxylases. Parmi d&#39;autres effets classiques, ascorbate contribue de manière significative à l&#39;anti-oxydation cellulaire en tant que chaîne de tomber en piégeur de radicaux soluble dans l&#39;eau 5 et au recyclage de la membrane plasmique α-tocophérol (vitamine E) par l&#39;intermédiaire de la réduction du radical α-tocophéroxyles 6, which est important dans la protection contre peroxydation des lipides membranaires 7. Il est important, bien que la plupart des mammifères sont capables de novo la synthèse hépatique de l&#39;ascorbate de D-glucose, les primates supérieurs, des cobayes et des chauves-souris dépendent de sources alimentaires de vitamine 8. Cela est dû à l&#39;inactivation du gène GULO, les orthologues de non affectées chez les mammifères qui codent pour l&#39;enzyme, γ-gulono-lactone oxydase 9-13. Cette enzyme est requise pour la réaction finale dans la biosynthèse de l&#39;ascorbate de 13 glucose. Après absorption de transporteur à médiation par de la lumière intestinale chez l&#39;homme, l&#39;ascorbate est distribué dans tout le corps par le système circulatoire. La vitamine se trouve généralement dans sa forme réduite à des concentrations millimolaires intracellulaire (à l&#39;exception notable des érythrocytes dans laquelle les concentrations sont généralement similaires à la concentration plasmatique en vigueur), et au concentré micromolesentrations (par exemple 50-200 pM) dans la plupart des liquides extracellulaires 14,15. Dans des conditions physiologiques, l&#39;ascorbate subit typiquement une oxydation à un électron réversible au radical ascorbyle libre (AFR, également connu sous le nom monodehydroascorbate ou semidehydroascorbate). Alors que l&#39;AFR est un radical relativement stable 16, en l&#39;absence de son rapide à un électron réduction enzymatique de retour à l&#39;ascorbate, deux RAS peut encore dismuter à un ascorbate et un déshydroascorbate (DHA) 9,13,17. A l&#39;intérieur de la cellule, le produit d&#39;oxydation à deux électrons de l&#39;ascorbate, le DHA, peut être rapidement ramené en arrière à l&#39;ascorbate et de la glutathion-NAD (P) H-enzymatique de charge et des réactions non enzymatiques 13. S&#39;il est classiquement admis que seulement le rôle important de l&#39;ascorbate dans le métabolisme du fer est de stimuler l&#39;absorption alimentaire de fer non hémique 18, nous et d&#39;autres avons fourni des preuves dece qui suggère que l&#39;ascorbate trongly joue un rôle considérablement élargi dans le métabolisme de ce métal. Tout d&#39;abord, l&#39;ascorbate qui est libérée par les cellules de l&#39;ascorbate-remplie semble jouer un rôle important dans la modulation de l&#39;absorption du fer non lié à la transferrine par les cellules 19,20, et la preuve très récente indique que l&#39;ascorbate module également l&#39;absorption du fer lié à la transferrine par des cellules 21, cette dernière, qui correspond à une importante absorption physiologique de fer-voie 22. Ascorbate est essentiel pour la fonction normale du système nerveux central chez les mammifères 23,24. En collaboration avec le cortex, de l&#39;hypophyse, du thymus, de la rétine et du corps jaune surrénale, le cerveau contient des concentrations élevées de l&#39;ascorbate par rapport à d&#39;autres tissus de l&#39;organisme 23,25-27. De plus, l&#39;exposition à la fois les astrocytes et les cellules 28,29 analogues à des neurones 30 de glutamate est connu pour déclencher la libération de l&#39;ascorbate dans l&#39;espace extracellulaire, où l&#39;ascorbatee est pensé pour aider à protéger les neurones contre la dysfonction neuronale induite par le glutamate 31. Bien que le mécanisme exact de induite par le glutamate-ascorbate de presse des astrocytes est inconnue, nous avons récemment apporté des preuves indiquant l&#39;implication de la cellule gonflement causé par une capture de glutamate par le glutamate des astrocytes et de l&#39;aspartate transporteur (GLAST, également appelée acide aminé excitateur transporteur isoforme 1 [EAAT1 ] chez l&#39;homme) et l&#39;activation consécutive de osmolyte et d&#39;anions canaux de volume sensible (VSOACs) qui sont perméables à de petits anions organiques tels que l&#39;ascorbate 32. Les identités moléculaires des conduits de membranes plasmatiques impliquées dans la formation VSOAC restent à identifier 33,34. Bien que de nombreux essais ont été développées pour la détermination de l&#39;ascorbate dans des échantillons biologiques, qui comprennent les dosages spectrophotométriques, fluorimétriques et 35,36 chromatographiques, il existe une grande variabilité dans la spécificité, la sensibilité, interference par les contaminants chimiques, la gamme linéaire efficace et la stabilité de l&#39;analyte du point de terminaison. En outre, d&#39;autres facteurs importants qui influent sur le choix de test sont la rapidité, la facilité d&#39;utilisation et l&#39;accès à un équipement relativement spécialisé, comme une chromatographie liquide à haute performance (CLHP) appareil. Ici, nous présentons un dosage simple et hautement spécifique microplaque colorimétrique pour la détermination de l&#39;ascorbate intracellulaire dans des cellules cultivées, ainsi que d&#39;un essai séparé pour la détermination de l&#39;ascorbate-efflux de cellules en culture. Le dernier test a pour but de contourner le problème de la sous-estimation de l&#39;ascorbate de presse à partir de cellules en raison de ré-absorption rapide de l&#39;ascorbate libéré par les transporteurs d&#39;ascorbate de sodium-dépendant (SVCTs). Bien que ces deux méthodes ont fait leur apparition dans certaines de nos publications précédentes 19,20,32,37,38, ce manuscrit fournit un ensemble explicite des instructions et des lignes directrices pour leur exécution effective.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Nunc 96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:135px;">Thermo</td>
			<td style="width:127px;">269620</td>
			<td style="width:132px;">Any flat-bottom 96-well plate can be used</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:284px;">Refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5415D</td>
			<td style="width:132px;">A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:74px;width:284px;">Refrigerated bench-top centrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5810R</td>
			<td style="width:132px;">Swing-bucket</td>
		</tr>
		<tr height="260">
			<td height="260" style="height:260px;width:284px;">Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer</td>
			<td style="width:135px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:284px;">Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">General-purpose buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:284px;">MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:284px;">HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2&#8226;2 H2O, 0.8 mM MgSO4&#8226;7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">General chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Highest purity preparations should be obtained</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30790</td>
			<td style="width:132px;">Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">C6762</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions prepared in DMSO or ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Ascorbate oxidase (AO)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A0157</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Potassium ferricyanide (FIC)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">455989</td>
			<td style="width:132px;">Trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&#8242;,5&#8242;&#8242;-disulfonic acid disodium salt)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">92940</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Sodium L-glutamate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Saponin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">47036</td>
			<td style="width:132px;">Prepare a 0.1% stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">3 M sodium acetate (pH 6.0)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.2 M citric acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">30 mM ferene-S</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stock solutions for ascorbate-efflux assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">AO (120 U/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">2.4 mM ferene-S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells

La vitamine C (ascorbate) joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement venir à la lumière au cours des dernières années. Par exemple, dans le cerveau, l&#39;ascorbate agit d&#39;une manière neuroprotecteur et neuromodulateur qui implique vélo ascorbate entre les neurones et les astrocytes vicinaux - une relation qui semble être essentiel pour le cerveau ascorbate homéostasie. En outre, la preuve émergente suggère fortement que l&#39;ascorbate a un rôle considérablement élargi dans la régulation du métabolisme du fer cellulaire et systémique que classiquement reconnu. La reconnaissance croissante du rôle intégrante de l&#39;ascorbate dans la physiologie cellulaire et organismique normale et déréglementé exige une gamme de moyen-débit et haute sensibilité des techniques analytiques qui peuvent être exécutées sans avoir besoin d&#39;équipement spécialisé très coûteux. Ici, nous fournissons des instructions explicites pour un débit moyen, essai de microplaques spécifique et relativement peu coûteux pour la détermination de boe ascorbate intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire.

Détermination de l&#39;ascorbate intracellulaire dans les cellules de suspension de culture Dans le premier essai (figure 1), l&#39;ascorbate intracellulaire est déterminée, à la suite de l&#39;ascorbate-spécifique (c.-à-AO-sensible) la réduction du ferricyanure en ferrocyanure, à l&#39;aide de la détermination hautement sensible de ferrocyanure par un mode opératoire déjà publié 37. La détection de l&#39;ascorbate est basée sur la colorimétr...

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A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Une microplaque de dosage rapide et spécifique pour la détermination de l&#39;ascorbate intra-et extracellulaire dans les cellules cultivées

Ascorbate joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement mis en lumière au cours des dernières années. Nous décrivons ici un débit moyen, dosage de microplaques spécifique et peu coûteux pour la détermination de l&#39;ascorbate à la fois intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire.

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

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